利用编码具有硫解酶、HMG-COA合酶和HMG-COA还原酶酶活性的多肽的基因产生甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯制造技术

本发明专利技术描述了通过异源表达来自生物体格氏李斯特菌DSM20601、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌EG2和铅黄肠球菌的mvaE和mvaS基因增加微生物中甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用编码具有硫解酶、HMG-COA合酶和HMG-COA还原酶酶活性的多肽的基因产生甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯相关专利申请的交叉引用本申请要求于2011年4月29日提交的美国临时专利申请No.61/481,098的优先权，特此将该专利的公开内容以引用的方式全文并入本文。
本公开涉及用于在微生物中增加甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯和类异戊二烯前体分子的产量的组合物和方法以及制备甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯和类异戊二烯前体分子的方法。专利技术背景R-甲羟戊酸是甲羟戊酸依赖性生物合成途径的中间体，该途径将乙酰辅酶A转化成异戊烯二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸。乙酰辅酶A向甲羟戊酸的转化可由上游甲羟戊酸依赖性生物合成途径（MVA途径）的硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶活性催化。根据葡萄糖经由糖酵解向乙酰辅酶A的摩尔转化率，利用MVA上游途径酶硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶产生甲羟戊酸的理论质量产率为54.8%。商业上，甲羟戊酸已被用作化妆品中的添加剂、用于生产可生物降解的聚合物，并且可具有用于合成其他化学品的手性构造块。甲羟戊酸依赖性途径的产物是异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是异戊二烯以及类异戊二烯的前体。异戊二烯（2-甲基-1,3-丁二烯）是天然橡胶的单体并且还是各式各样的其他天然存在的化合物（统称为类异戊二烯）的共同结构基序(structuralmotif)异戊二烯此外还是多种合成聚合物（最值得注意的是合成橡胶）的关键原料。类异戊二烯是衍生自类异戊二烯前体分子IPP和DMAPP的化合物。已鉴定了超过29,000种类异戊二烯化合物并且每年都发现新的类异戊二烯。类异戊二烯可分离自天然产物，例如将类异戊二烯前体分子用作基础构造块以形成类异戊二烯的相对复杂结构的微生物和植物物种。类异戊二烯对大多数活生物体和细胞是至关重要的，为维持细胞膜流动性和电子传递提供了手段。在自然界，类异戊二烯发挥的作用多种多样，从作为植物中的天然杀虫剂到促成与肉桂、丁香和生姜相关的香味。此外，制药和化学界将类异戊二烯用作药品、保健营养品、调味剂和农业害虫防治剂。鉴于它们在生物系统中的重要性以及在广泛应用中的有用性，类异戊二烯已成为倍受科学家重视的焦点。获得甲羟戊酸和类异戊二烯的常规手段包括从生物材料（如植物、微生物和动物）提取以及在实验室中部分有机合成或全有机合成。然而，这类手段通常已证明差强人意。尤其对于类异戊二烯，鉴于通常其分子结构的复杂性，考虑到通常需要若干步骤来获得所需产物，因而有机合成是不切实际的。另外，这些化学合成步骤可涉及使用毒性溶剂，同样从生物材料提取类异戊二烯也可涉及使用毒性溶剂。此外，这些提取和纯化方法通常导致所需类异戊二烯产率相对较低，因为生物材料通常仅含有微量的这些分子。不幸的是，获得相对大量的类异戊二烯所涉及的困难已限制了它们的实际应用。已公开了以一定速率、滴度和纯度产生异戊二烯和类异戊二烯的方法（参见例如国际专利申请公开No.WO2009/076676A2和美国专利No.7,915,026）。然而，仍需要增加异戊二烯和类异戊二烯的产量以及增加异戊二烯和类异戊二烯的产率的改进。本专利技术通过公开组合物和方法以增加作为甲羟戊酸依赖性生物合成途径的中间体的甲羟戊酸的产量以及增加衍生自甲羟戊酸的分子如异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量而提供了这类改进。在整篇本说明书中，参考了多个专利、专利申请以及其他类型的出版物（如杂志文章）。特此将本文引用的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。
技术实现思路
本文提供的专利技术尤其公开了增加重组细胞的异戊二烯产量的组合物和方法。本专利技术还提供通过表达（如异源表达）来自生物体格氏李斯特菌(Listeriagrayi)DSM20601、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)EG2和铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)的mvaE和mvaS基因增加微生物中甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法。因此，本专利技术提供的是能够增加异戊二烯的产量的重组细胞，该细胞包含一种或多种包含选自如下的核苷酸序列的异源核酸：来自鹑鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；来自铅黄肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；来自屎肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；和来自格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因，其中所述mvaE基因和mvaS基因编码具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶催化活性的多肽，并且其中该细胞还包含：一种或多种编码MVA下游途径的多肽的核酸；和编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中与不包含所述mvaE基因和mvaS基因的产异戊二烯细胞相比，该细胞产生增加量的异戊二烯。在一些方面，编码MVA下游途径的多肽的核酸包含选自如下的酶：(a)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶；(b)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。在任何本文所公开方面的一些方面中，将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶选自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烷球菌(Methanococcoidesburtonii)甲羟戊酸激酶多肽、乳杆菌(Lactobacillus)甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲羟戊酸激酶多肽、链球菌(Streptococcus)甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)甲羟戊酸激酶多肽和链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽。在一些方面，将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。在任何本文所公开方面的一些方面中，该异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂种银白杨(Populusalba)x欧洲山杨(Populustremula)的多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽选自山葛(Puerariamontana)、野葛(Puerarialobata)、美洲山杨(Populustremuloides)、银白杨、黑杨(Populusnigra)、毛果杨(Populustrichocarpa)。在一些方面，植物异戊二烯合酶多肽为银白杨异戊二烯合酶多肽。在任何本文所公开方面的一些方面中，该细胞还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸δ-异构酶(IDI)多肽的核酸。在一些方面，其中编码IDI多肽的核酸为编码IDI多肽的异源核酸。在一些方面，IDI多肽为酵母IDI多肽。在一些方面，编码IDI多肽的核酸为编码IDI多肽的内源核酸拷贝。在任何本文所公开方面的一些方面中，将该一种或多种核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。在任何本文所公开方面的一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.29 US 61/481,0981.一种能够增加异戊二烯的产量的重组细胞，所述细胞包含一种或多种包含选自如下的核苷酸序列的异源核酸：a.核苷酸序列，所述核苷酸序列是鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarum)的mvaE基因和mvaS基因；b.核苷酸序列，所述核苷酸序列是铅黄肠球菌(Enterococcuscasseliflavus)的mvaE基因和mvaS基因；c.核苷酸序列，所述核苷酸序列是屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的mvaE基因和mvaS基因；和d.核苷酸序列，所述核苷酸序列是格氏李斯特菌(Listeriagrayi)的mvaE基因和mvaS基因其中所述mvaE基因和mvaS基因编码具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶催化活性的多肽，并且其中所述细胞还包含：i.编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；和ii.一种或多种编码MVA下游途径的多肽的核酸，其中与不包含所述mvaE基因和mvaS基因的产异戊二烯细胞相比所述细胞产生增加量的异戊二烯。2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述编码MVA下游途径的多肽的核酸包含编码选自如下酶的核酸：(a)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶；(b)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶选自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烷球菌(Methanococcoidesburtonii)甲羟戊酸激酶多肽、乳杆菌(Lactobacillus)甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌(Streptococcus)甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌(Streptomyces)甲羟戊酸激酶多肽。4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)甲羟戊酸激酶多肽、和链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽。5.根据权利要求3所述的细胞，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。6.根据权利要求1所述的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽。7.根据权利要求6所述的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽为来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)的多肽。8.根据权利要求7所述的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽选自山葛(Puerariamontana)、野葛(Puerarialobata)、美洲山杨(Populustremuloides)、银白杨(Populusalba)、黑杨(Populusnigra)、毛果杨(Populustrichocarpa)和杂种银白杨x欧洲山杨。9.根据权利要求6所述的细胞，其中所述植物异戊二烯合酶多肽为银白杨异戊二烯合酶多肽。10.根据权利要求1所述的细胞，还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸δ-异构酶(IDI)多肽的核酸。11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述编码IDI多肽的核酸为编码IDI多肽的异源核酸。12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述IDI多肽为酵母IDI多肽。13.根据权利要求10所述的细胞，其中所述编码IDI多肽的核酸为编码IDI多肽的内源核酸拷贝。14.根据权利要求1所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。15.根据权利要求1所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸克隆进多拷贝质粒中。16.根据权利要求1所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸整合进所述细胞的染色体中。17.根据权利要求1-16中任一项所述的细胞，其中所述细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞。18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述细菌细胞为埃希杆菌(Escherichia)细胞、泛菌(Pantoea)细胞，所述真菌细胞为丝状真菌细胞或酵母细胞。19.根据权利要求18所述的细胞，其中所述丝状真菌细胞为木霉(Trichoderma)细胞或曲霉(Aspergillus)细胞。20.根据权利要求17所述的细胞，其中所述细胞选自大肠杆菌细胞、柠檬泛菌(Pantoeacitrea)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)细胞、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)细胞、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)细胞、耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)细胞、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)细胞、白色链霉菌(Streptomycesalbus)细胞、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)细胞、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)细胞、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)细胞、假单胞菌属物种(Pseudomonassp.)细胞和产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)细胞。21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞为大肠杆菌。22.一种产生异戊二烯的方法，包括：(a)在适于产生异戊二烯的培养条件下培养根据权利要求1所述的重组细胞；以及(b)产生异戊二烯。23.根据权利要求22所述的方法，还包括(c)回收异戊二烯。24.能够增加类异戊二烯前体的产量的重组细胞，所述细胞包含一种或多种包含选自如下的核苷酸序列的异源核酸：(a)核苷酸序列，所述核苷酸序列是鹑鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)核苷酸序列，所述核苷酸序列是铅黄肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(c)核苷酸序列，所述核苷酸序列是格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因，其中所述mvaE基因和mvaS基因编码具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶催化活性的多肽，并且其中与不包含所述mvaE基因和mvaS基因的产类异戊二烯前体细胞相比所述细胞产生增加量的类异戊二烯前体，其中所述类异戊二烯前体是甲羟戊酸。25.根据权利要求24所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。26.根据权利要求24所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸克隆进多拷贝质粒中。27.根据权利要求24所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸整合进所述细胞的染色体中。28.根据权利要求24所述的细胞，其中所述细胞为革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞。29.根据权利要求28所述的细胞，其中所述细菌细胞为埃希杆菌细胞、泛菌细胞，所述真菌细胞为丝状真菌细胞或酵母细胞。30.根据权利要求29所述的细胞，其中所述丝状真菌细胞为木霉细胞或曲霉细胞。31.根据权利要求28所述的细胞，其中所述细胞选自大肠杆菌细胞、柠檬泛菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、迟缓芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、嗜碱芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、耐盐芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、灿烂芽孢杆菌细胞、苏云金芽孢杆菌细胞、白色链霉菌细胞、变铅青链霉菌细胞、天蓝色链霉菌细胞、灰色链霉菌细胞、假单胞菌属物种细胞和产碱假单胞菌细胞。32.根据权利要求31所述的细胞，其中所述细胞为大肠杆菌。33.根据权利要求24-32中任一项所述的细胞，其中所述类异戊二烯前体为甲羟戊酸(MVA)。34.一种产生类异戊二烯前体的方法，包括：(a)在适于产生类异戊二烯前体的培养条件下培养根据权利要求24所述的重组细胞；以及(b)产生所述类异戊二烯前体。35.根据权利要求34所述的方法，还包括(c)回收所述类异戊二烯前体。36.能够增加类异戊二烯的产量的重组细胞，所述细胞包含一种或多种包含选自如下的核苷酸序列的异源核酸：(a)核苷酸序列，所述核苷酸序列是鹑鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(b)核苷酸序列，所述核苷酸序列是铅黄肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(c)核苷酸序列，所述核苷酸序列是屎肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；和(d)核苷酸序列，所述核苷酸序列是格氏李斯特菌的mvaE基因和mvaS基因，其中所述mvaE基因和mvaS基因编码具有硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶催化活性的多肽，并且其中所述细胞还包含：i.一种或多种编码聚丙烯焦磷酸合酶的核酸；和ii.一种或多种编码MVA下游途径的多肽的核酸，其中与不包含所述mvaE基因和mvaS基因的产类异戊二烯细胞相比所述细胞产生增加量的类异戊二烯。37.根据权利要求36所述的细胞，其中所述编码MVA下游途径的多肽的核酸包含编码选自如下酶的核酸：(a)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶；(b)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸的酶；和(c)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。38.根据权利要求37所述的细胞，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶选自马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶多肽、乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌甲羟戊酸激酶多肽。39.根据权利要求38所述的细胞，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶选自酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶多肽、和链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽。40.根据权利要求38所述的细胞，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。41.根据权利要求36所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。42.根据权利要求36所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸克隆进多拷贝质粒中。43.根据权利要求36所述的细胞，其中将所述一种或多种核酸整合进所述细胞的染色体中。44.根据权利要求36所述的细胞，其中所述细胞为革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞。45.根据权利要求44所述的细胞，其中所述细菌细胞为埃希杆菌细胞、泛菌细胞，所述真菌细胞为丝状真菌细胞或酵母细胞。46.根据权利要求45所述的细胞，其中所述丝状真菌细胞为木霉细胞或曲霉细胞。47.根据权利要求44所述的细胞，其中所述细胞选自大肠杆菌细胞、柠檬泛菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、迟缓芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、嗜碱芽孢杆菌细胞、解...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z·Q·贝克，M·C·米勒，C·M·派瑞斯，Y·A·普里马克，J·P·普奇，D·H·韦尔斯，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，固特异轮胎和橡胶公司，
类型：
国别省市：