用于悬液细胞培养的方法和系统技术方案

本发明专利技术公开了一种使宿主细胞适应悬浮细胞培养的体系和方法，以及据此制备的细胞系。所述方法包括将大量未稀释的培养细胞在表面区域上连续接种，直至细胞团直观可见，然后在细胞成团时，将细胞移至悬浮培养体系。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术公开了一种使宿主细胞适应悬浮细胞培养的体系和方法，以及据此制备的细胞系。所述方法包括将大量未稀释的培养细胞在表面区域上连续接种，直至细胞团直观可见，然后在细胞成团时，将细胞移至悬浮培养体系。【专利说明】用于悬液细胞培养的方法和系统相关申请此专利文件根据法条35U.S.C.§ 119(e)，要求2011年I月5日提交的美国临时专利申请61/429，931的优先权，该申请的内容在此通过引用的方式并入本文。
技术介绍
生产基于重组蛋白的生物药品是一项复杂且劳动和资本密集的尝试。目前，哺乳动物细胞被应用于大多数人蛋白的制造中。典型的哺乳动物细胞含有大量转译后修饰内容，此类修饰无法由无修饰原核细胞和无修饰单细胞真核生物完成。虽然如中国仓鼠卵巢细胞和仓鼠崽肾细胞一类的哺乳动物细胞能够忠实地完成大多数人蛋白的生物合成，其效率却 远远低于细菌或酵母细胞能达到的程度。目前市场销售的重组蛋白之中，fVIII的生产效率最为低下，也是目前每单位质量成本最高的(图1)。重组fVIII是X-染色体相关的先天出血性疾病血友病A的首选治疗方案。该治疗方案包括每周2-3次fVIII静脉注射，花费为每年约100，000-300, 000美元(Bohn RL, Avorn J, Glynn RJ, Choodnovskiy I, Haschemeyer R, Aledort LM.Prophylacticuse of factor VII1: an economic evaluation.Thromb Haemost.1998; 79 (5): 932-7，在此全文引述)。因此，全世界仅有不到三分之一的血友病A患者能够得到此项治疗。有史以来，fVIII—直供不应求，价格也由于高昂的研究、开发和制造成本而一直过高。要改善血友病A及其他可采用蛋白替补疗法的单基因疾病的治疗条件，一种方法是开发生产效率更高的重组蛋白制造方法。当代最先进的重组h-fVIII制剂一般以哺乳动物细胞，如BHK-21或中国仓鼠卵巢细胞，以大规模发酵生物反应器进行生产。可通过若干技术最大化重组h-fVIII的产量，包括⑴以DHFR/甲氨蝶呤选择法扩增h-fVIII转基因；⑵向培养基中加入fVIII稳定剂(例如:牛/人血清蛋白或利用vWf共表达)，以及(3)以连续注入式发酵令细胞生长率/密度最大化。然后，通过一系列过滤、免疫亲和性、分子排阻及离子交换色谱步骤，将fVIII从条件培养基提纯。通常，还要在提纯流程中加入病毒灭活步骤来提高安全性。一旦经过提纯，就可以依照配方向fVIII材料中加入稳定剂，干燥冷冻，然后进行包装。这一标准化的制造过程已在 Boedeker BG.Production processes of licensed recombinant factorVIII preparations.Semin Thromb Hemost.2001; 27 (4): 385-94 中论述，在此全文引述。第一代重组fVIII制剂以人血清蛋白作为稳定剂，但后者理论上可能携带病毒污染物。为了减少病毒污染物的风险，出现了被认为是“不含动物制品”的第二代和第三代的fVIII制剂，以蔗糖和其他添加物作为稳定剂。由于认为新生代重组制剂比血浆源性制剂和第一代制剂具有较高的安全性，许多已接受过治疗和大多数尚未接受治疗的病患都转向了第二代和第三代fVIII制剂。这样的需求导致了数次fVIII制剂短缺，也催生了暂时性定量配给 fVIII 制剂的应对方针(Garber K.rFactor VIII deficit questioned.NatBiotechnol.2000; 18(11):1133,在此作为参考文献引述)。若干论文表明，重组人体fVIII的标准生产水平为〈I单位/IO6个细胞/天(Kaufman RJ, Pipe SW, Tagliavacca L, Swaroop M, Moussalli M.Biosynthesis, assemblyand secretion of coagulation factor VII1.Blood CoagulFibrinoIysis.1997;8Suppl2:S3-14.:S3-14,在此作为参考文献引述)。典型情况下，重组人体fVIII制剂成品的比活性为4000-10，000单位每毫克蛋白，而一名体重70kg的成人一次治疗的花费在2，500 - 5，000美元。目前，fVIII制剂具有60-80亿美元的年需求，然而事实上，该产品只能满足不到三分之一的潜在全球市场。【专利附图】【附图说明】图1为目前生物制药制造业的格局图示；图2展示了从BHK-M细胞到BHK-Ms细胞的转变；BHK_M细胞适于利用一种未授权专利方法来实现悬浮，该方法包括贴壁BHK-M细胞的连续重复接种；图3展示了无血清培养基中，BHK-Ms细胞的重组fVIII表达；图4展示了 HEK-293T细胞从贴壁到悬浮的转换；图5展示了适应悬浮的细胞中fVIII高水平表达的证据图表； 图6为展示最佳饲喂时间表的结果的点图；图7展示了依照在此公开的方法适应悬浮后的另一克隆系；图8展示了依照在此公开的方法适应悬浮后的另一克隆系的密度和活力；图9展示了依照在此公开的方法适应悬浮后的一个克隆系中fVIII的活性随密度的变化；图10为一枚GFP转染且制造GFP病毒的细胞的图像，该细胞依照在此公开的方法适应悬浮；且图11比较了 BHK-M (贴壁)和BHK-Ms (悬液)培养平台的重组FVIII产量。【具体实施方式】我们公开一种令此前限于贴壁培养体系的哺乳动物细胞系适应悬浮细胞培养，例如但不限于滚瓶的新颖方法。我们还公开了定名为BHK-MS-310、BHK-MS-PHh和SC-293T的在重组蛋白悬液培养中表现出(较于已知的体系和方法)改良产量的新颖细胞系。另外，我们公开了一种悬液细胞病毒制造的新颖方法。在此公开的方法、体系和细胞系都具有适应性，且适应于无血清和无血蛋白的悬液培养环境。我们这项发现的新颖性和重要性不可低估。许多对人(或动物)健康和福利至关重要的生物治疗药物，由于生产制造中似乎无法克服的深层困难，不是无法生产，就是供应量极为有限。一些情况下，生产这些蛋白的最适宜细胞系受限于贴壁细胞生产。贴壁细胞生产具有较低的效率和扩展性，且与其他方法，例如，但不限于，悬浮细胞培养，相比更不适合大规模商业化生物制造。因此，令传统的贴壁细胞系适应悬浮细胞培养(例如但不限于，从前在已知方法下无法适应的贴壁细胞系)是一项显著的成就。更进一步，对于此前成功令贴壁细胞适应悬浮细胞培养的方法，在此公开的方法和体系也可作为一种新颖的替代方法。重组人体fVIII是一种典型的出名难以制造的生物治疗药物。目前市场上销售的重组人体fVIII制剂的产量比其他重组生物治疗药物，例如但不限于，单克隆抗体，低100-1000倍。fVIII表达产率低对产品价格和供应量造成了强烈影响。事实上，在所有主流生物制药中，重组fVIII具有最高的价格点和最低的年产量，其药房价格为10，000, 000每克，而全球总年产量不到0.5千克。fVIII表达效率低所导致的后果之一，就是全球血友病A患者中，只有不到三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：加布里埃拉·Dc·丹宁，理查德·E·高特妮，
申请(专利权)人：爱克斯普雷森治疗有限责任公司，
类型：
国别省市：