一种血吸虫谷胱甘肽‑S‑转移酶的突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种血吸虫谷胱甘肽‑S‑转移酶的变体以及其应用。本发明专利技术提供了一种改变血吸虫免疫保护性的血吸虫谷胱甘肽‑S转移酶(sj26GST)突变酶，将来源于日本血吸虫（

【技术实现步骤摘要】
一种血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶的突变体及其应用
本专利技术属于酶的基因工程
，具体涉及一种血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶的变体以及其应用
技术介绍
血吸虫病是一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病，我国主要流行日本血吸虫病，广泛流行于我国长江沿岸以及四川、云南省等地，急性感染病例时有发生，虽然化学药物对血吸虫病的有治疗作用，但不能阻断血吸虫的反复感染，另外目前唯一治疗血吸虫病的药物吡喹酮已经有了耐药性的报道，因此,研制有效的血吸虫病疫苗和新药物报表的筛选显得十分重要。目前的血吸虫疫苗所诱导的免疫保护力普遍水平不高，仅能诱导出宿主对血吸虫感染的部分抵抗力。血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(sjGST)是血吸虫生理功能所需的重要解毒酶，对虫体的生理功能起重要作用，是最具发展前途的血吸虫病候选分子疫苗之一。日本血吸虫26kDGST基因能够在大肠杆菌中高效表达(sj26GST),用sj26GST直接免疫小鼠,可以在宿主体内诱导保护性免疫反应，sj26GST抗原分子的研究是日本血吸虫疫苗研究的热点。由于血吸虫是一种多细胞生物，生活史复杂。感染后宿主保护性免疫机制复杂，因此提高疫苗分子的免疫效果是当前血吸虫病疫苗研究主要方向。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种改变血吸虫免疫保护性的血吸虫谷胱甘肽-S转移酶(sj26GST)突变酶，将来源于日本血吸虫(Schistosomajaponicum)的26kDa的谷胱甘肽-S转移酶进行突变所得的单突变酶与野生型相比，所述的sj26GST的突变酶的保护性获得提高，突变酶IgG1水平显著高于重组野生型sj26GST蛋白，减虫率由原来的34％提高到40％，减卵率由37％提高到40％。该重组抗原具有良好的免疫原性，适于作为抗血吸虫病候选疫苗。具体的，本专利技术提供了一种谷胱甘肽S-转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体谷胱甘肽S-转移酶的第67位的氨基酸进行了突变，且该突变体的免疫原性显著强于其亲本。进一步的，所述的第67位的谷氨酰胺(Gln)替换为谷氨酸(Glu)。进一步的，所述突变体是源于日本吸血虫(Schistosomajaponicum)的26kD谷胱甘肽-S转移酶的突变。进一步的，上述谷胱甘肽S-转移酶的突变体的氨基酸序列如SEQID：NO4所示。另一方面，本专利技术还提供了所述的谷胱甘肽S-转移酶的突变体在制备治疗血吸虫病的疫苗中的应用。另一方面，本专利技术还提供了一种核酸分子，其编码上述任一项所述的谷胱甘肽S-转移酶的突变体。进一步的，上述的核苷酸序列如SEQID：NO3所示。另一方面，本专利技术还提供了一种重组表达质粒，其含有上述的核苷酸分子。本专利技术还提供sj26GST的突变酶Q67E的制备方法，其具体步骤为：(1)设计定点突变的突变引物，以携带sj26GST酶基因的载体为模板进行定点突变构建突变质粒pET-21d-Q67E；(2)将突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆发酵培养；(3)离心菌体，重悬后超声，亲和层析纯化得到突变体Q67E。本专利技术中所述来源Schistosomajaponicum的sj26GST在GenBank的编号为M14654.1,基因全长657个核苷酸，见序列表中SEQIDNo：1，编码218个氨基酸，见序列表中SEQIDNo：2。所述sj26GST的突变酶是将其67位氨基酸谷氨酰胺Gln突变为谷氨酸Glu，命名为Q67E。Q67E的核苷酸序列见序列表中SEQIDNo.3，氨基酸序列见表中SEQIDNo:4。本专利技术在对谷胱甘肽-S转移酶的结构、功能以及对日本血吸虫保护性研究的基础上，通过定点突变的方法，对日本血吸虫来源的sj26GST进行分子改造，发现该突变酶诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体并能达到一个较高的水平，IgG1较重组野生型蛋白有显著提高，动物保护实验诱导了40％的减虫率和40％的减卵率，表明该重组谷胱甘肽-S转移酶突变酶适于作为抗血吸虫病候选疫苗，本专利技术还表明sj26GST蛋白质的67位氨基酸的突变对血吸虫的免疫性保护反应有重要影响，本研究可为筛选和设计血吸虫疫苗候选分子提供新思路。附图说明图1是本专利技术实施例2重组野生型酶sj26GST与突变体酶Q67E表达纯化结果图。图2是本专利技术实施例3重组sj26GST突变酶与野生型酶Q67E酶活，突变酶Q67E的酶活性小于野生型sj26GST。图3和图4是本专利技术实施列4突变体酶Q67E与野生型sj26GST相比,突变酶的减虫率较野生酶提高到40％。图5和图6是本专利技术实施列4突变体酶Q67E与野生型sj26GST相比,突变酶的减卵率较野生酶提高到40％。图7和图8是本专利技术实施列4野生型酶sj26GST与突变体酶Q67E特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平的检测比较结果图。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，按常规条件，如《分子克隆实验指南》第3版(J.莎姆布鲁克、D.W.拉塞尔等主编，黄培堂等译.北京，科学出版社，2005)中所述方法进行。实施例1sj26GST及其变体Q67E原核表达载体的构建和蛋白纯化以质粒pALEX为模板，用PCR的方法扩增野生型GST的编码序列。所用的上游引物为：5’-catgccatgggcatgtcccctatactaggttattgg-3’引入NcoI的酶切位点(下划线)，下游引物为：5’-ctgtagcggccgctctagactcgagttttggaggatggtcgccac-3’，引入XhoI(下划线)的酶切位点。PCR产物纯化后用NcoI/XhoI双酶切，插入pET21d的相应位点。对重组表达载体进行DNA测序，分析其阅读框架和编码序列的正确性。突变蛋白Q67E的序列和野生型GST构建的N/C端序列一致，仅在特定位点进行定点突变。此构建的GST在C末端额外加上了LEHHHHHH，以便纯化。突变引物如下所示：锚定引物和定点突变用引物的磷酸化反应：在两个PCR反应管中分别配制下列两种引物的磷酸化反应液，各反应管在37℃水浴中反应30min，再在70℃水浴中加热10min，置于-20℃保存备用。(1)锚定引物的磷酸反应液：(2)定点突变用引物的磷酸化反应液：退火反应：在PCR反应管中配制下列反应液，99℃加热3min，经30min缓慢降至45℃，在45℃保温10sec后，再降温至4℃adsDNA模板为野生型GST的PCR产物，每个反应模板的量为100ng。b10×AnnealingBuffer:200mMTris-HCl,pH7.5,500mMNaCl,100mMMgCl2.延伸、连接反应：将下列组分混合后加入到退火反应液中，37℃水浴锅中反应2hr。PCR扩增反应：按下列组分配制PCR反应液，总体积为50μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min；随后94℃变性40sec，55℃退火50sec，72℃延伸1min，进行28个循环，最后72℃保温7min经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR扩增产物经限制性内切酶NcoI和XhoI消化后连接至载体pET-21d，并转至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜。挑取单菌落，应用菌落PCR方法筛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种吸血虫谷胱甘肽S‑转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体谷胱甘肽S‑转移酶的第67位的氨基酸进行了突变，且其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
2014.11.06 CN 201410619096X1.一种血吸虫谷胱甘肽S-转移酶的突变体，其特征在于，所述突变体谷胱甘肽S-转移酶的第67位的氨基酸进行了突变，且其氨基酸序列如SEQIDNO：4...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，李家璜，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32