用于合成色胺和色胺类似物的衍生物的生物催化剂和方法技术

本公开内容提供了用于产生胺的工程化转氨酶多肽、编码该工程化转氨酶的多核苷酸、能够表达该工程化转氨酶的宿主细胞、以及使用该工程化转氨酶制备在产生活性药物试剂中有用的化合物的方法。本公开内容提供了具有转氨酶活性的工程化多肽、编码该多肽的多核苷酸、制备该多肽的方法、和使用该多肽用于将酮底物生物催化转化为胺产物的方法。本发明专利技术的酶已被工程化为具有与河流弧菌(Vibrio fluvialis)的天然存在的转氨酶的氨基酸序列相比的一个或更多个残基差异。特别是，本公开内容的转氨酶已被工程化为从其相应的前手性酮底物有效形成手性色胺衍生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于合成色胺和色胺类似物的衍生物的生物催化剂和方法1.
本公开内容涉及转氨酶生物催化剂以及使用该生物催化剂制备色胺和色胺类似物的衍生物的方法。2.对序列表、表格或计算机程序的引用序列表的正式文本作为ASCII格式文本文件与说明书经EFS-Web同时被提交，文件名为“CX2-105USP1_ST25.txt”，创建日期为2012年3月23日，且大小为457,542千字节。经EFS-Web提交的序列表为本说明书的一部分，并且通过引用以其整体并入本文。3.背景色胺类化合物具有核心通式色胺和色胺类似物的衍生物，诸如同质色胺(homotryptamine)，可对胺上的α-碳、β-碳和吲哚环进行取代。因为此类衍生物与神经递质血清素和褪黑激素在结构上相似，许多具有精神活性属性。例如，5-羟基-N,N-二甲基色胺、N,N-二甲基色胺、4-羟基-N,N-二甲基色胺、5-甲氧基-α-甲基色胺、α-甲基色胺、和α-乙基色胺具有致幻性质并在美国被规定为列表1管制物质(Schedule1ControlledSubstances)。色胺、色胺类似物及其衍生物还形成了许多药物化合物的骨架，例如致幻剂麦角酰二乙胺(LSD)、抗疟原虫药螺吲哚酮(Yeung等人，2010,JMedChem.53:5155–5164)，痛觉螺环己烷衍生物(美国专利公布号20100240897)，以及法尼酯X受体拮抗剂氮杂卓并吲哚(azepinoindole)衍生物(美国专利公布号20100173824)。在α-碳处具有取代基的色胺衍生物，例如α-甲基色胺、或以及α-乙基色胺，导致手性中心，并且这些对映体已显示了展示不同的生物活性。例如，α-甲基色胺的S-异构体显示比R-异构体更大的效力(参见，例如，D.B.Repke等人，1976,JHeterocyclChem.13:775)。具有手性α-甲基色胺或α-甲基同质色胺组分的抗疟原虫药螺吲哚酮的不同异构体，也显示不同的效力，例如(1R,3S)异构体显示比(1R,3R)异构体更高的抗疟原虫活性(参见上述Yeung；WO2009/132921)：制备手性α-碳取代的色胺和色胺类似物，诸如α-甲基色胺和α-甲基同质色胺，可采用分离/隔离期望的异构体或使用采用手性起始化合物用于不对称合成的化学合成途径。后者的示例是合成抗疟原虫药螺吲哚酮，其可使用D-色氨醇作为起始化合物用于合成手性中间体S-α-甲基色胺(上述Yeung等人)。用于制备手性化合物的其他一般方法包括与保留手性的无手性试剂连续反应，使用掺入了对映体纯的手性中心的试剂或催化剂以转换对映体为具有不同反应性的非对映体，使用化学手性催化剂以及手性助剂化合物。分离并隔离对映体可以是费时的，而化学不对称合成策略可受限于分子可经历的可能反应，需要苛刻的反应条件和/或复杂的合成路线。实例是D-色氨醇在合成螺吲哚酮中的可用性，其由于其合成需要的复杂的合成步骤而受限。因此，期望开发用于制备α-取代的色胺及结构上相关的类似物的合成方法，该方法使用温和条件，导致期望的手性化合物的高对映体过量，具有起始原料至期望的产物的高转化，并且是成本有效的。4.概述本公开内容提供了具有转氨酶活性的工程化多肽、编码该多肽的多核苷酸、制备该多肽的方法、以及使用该多肽用于生物催化转化酮底物为胺产物的方法。与河流弧菌(Vibriofluvialis)的天然存在的转氨酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)和具有增强的溶剂稳定性和热稳定性的参考工程化转氨酶的氨基酸序列(SEQIDNO:4)相比，本专利技术的酶已被工程化为具有一个或更多个残基差异，其中残基差异存在于影响以下各种酶特性的残基位置上：包括活性、立体选择性、稳定性、表达、和产物耐受性，以及其他。特别地，本公开内容的转氨酶已被工程化为从其相应的前手性酮底物有效形成手性色胺衍生物。因此，本文公开的工程化多肽展示了在从相应的前手性酮底物形成色胺衍生物中，特别是在底物化合物(2)，1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-酮向产物化合物(1)，(S)-1-(1H-5-氟-6-氯-吲哚-3-基)丙-2-胺的转化中，增加的活性、溶剂稳定性和热稳定性、增加的产物耐受性、以及高立体选择性，以及其他，因此，在一个方面，本公开内容提供了具有转氨酶活性的工程化多肽，其中该工程化多肽包括具有与SEQIDNO:2或4的至少80％同一性和与SEQIDNO:4相比在选自以下的残基位置上的一个或更多个残基差异的氨基酸序列：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中在残基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417处的残基差异选自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。在一些实施方案中，在残基位置X14；X26；X33；X41；X47；X70；X88；X107；X132；X148；X173；X203；X250；X284；X315；X346；X395；X400；X419；X423；X448；和X451处的残基差异选自X14V；X26R；X33T；X41L；X47N；X70A；X88A；X88L；X107P；X132F；X148Q；X148R；X173A；X203S；X250A；X284A；X315G；X346L；X395P；X400G；X419S；X423I；X448E；和X451D。如本文所提供，在一些实施方案中，公开的残基差异可单独或以各种组合被用于产生具有改进的酶特性的工程化多肽。在本文详细的说明书中提供了关于残基差异的选择和对酶特性的影响的指导。在一些实施方案中，工程化转氨酶多肽包括具有与参考序列SEQIDNO:4的至少80％序列同一性和与SEQIDNO:4相比在选自以下的残基位置上至少一个残基差异的氨基酸序列：X14、X86、X163、或X400。在一些实施方案中，氨基酸序列具有在位置X163上的至少一个残基差异，其中氨基酸残基选自I、L、R和V。在一些实施方案中，工程化转氨酶多肽包括具有与SEQIDNO:4相比选自以下的残基差异的组合的氨基酸序列：(a)X14V和X163I/L/R/V；(b)X86D和X400G；(c)X57F/Y和X163I/L/R/V；(d)X57F/Y和X398L/V/W；(e)X14V、X113L/V、X163I/L/R/V、X284A、和X424V；以及(f)X31S、X57F/Y、X163I/L/R/V、X315G、X346L、和X398L/V/W。在一些实施方案中，工程化转氨酶多肽包括具有与SEQIDNO:4相比选自以下的残基差异的组合的氨基酸序列：(a)X14V、X113L、X163L、X284A、和X424V；(b)X14V、X26R、X163L、X284A、和X400G；(c)X14V、X2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有转氨酶活性的工程化多肽，所述工程化多肽包括具有与SEQ ID NO:4的至少80％同一性和与SEQ ID NO:4相比在选自以下的残基位置上的一个或更多个残基差异的氨基酸序列：X14；X26；X31；X33；X41；X47；X57；X70；X86；X88；X107；X132；X148；X163；X168；X173；X203；X250；X284；X314；X315；X324；X346；X395；X398；X400；X417；X419；X423；X448；和X451，其中在残基位置X31；X57；X86；X163；X168；X314；X324；X398；和X417上的残基差异选自：X31S；X57Y；X86D；X163I；X163L；X163R；X163V；X168S；X314N；X324H；X398L；X398V；X398W；和X417M。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.23 US 61/614,6661.一种具有转氨酶活性的工程化多肽，所述工程化多肽的序列基于SEQIDNO:4并且与SEQIDNO:4相比，所述工程化多肽中的残基差异是X163L/I/V，任选地与选自以下的一个或更多个残基差异组合：X14V、X26R、X31S、X33T、X41L、X57F/Y、X86Y、X88L/A、X107P、X113L/V、X132F、X148Q、X168S/K、X173A、X203S、X284A、X314N、X315G、X324H、X346L、X383A、X395P、X398V/W/L、X400G、X417M、X419S、X420N、X423I、X424V、X448E和X451D。2.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽中的残基差异是X163L/I/V与选自以下的一个或更多个残基差异的组合：X14V；X26R；X33T；X41L；X88A；X88L；X107P；X132F；X148Q；X173A；X203S；X284A；X315G；X346L；X395P；X400G；X419S；X423I；X448E；和X451D。3.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽中的残基差异是X163L/I/V与选自X14V；X26R；X33T；X41L；X88A；X88L；X107P；X132F；X148Q；X173A；X203S；X284A；X315G；X346L；X395P；X400G；X419S；X423I；X448E；和X451D的一个或更多个残基差异以及选自X57F；X113L；X113V；X168K；X420N；和X424V的一个或更多个残基差异的组合。4.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽中的残基差异是X163I/L/V与选自以下的至少一个或更多个残基差异的组合：X14V；X26R；X31S；X284A；X315G；X398L/V/W；和X400G。5.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽中的残基差异是选自以下的残基差异组合：X14V和X163I/L/V；X57F/Y和X163I/L/V；X14V、X113L/V、X163I/L/V、X284A、和X424V；X31S、X57F/Y、X163I/L/V、X315G、X346L、和X398L/V/W；X14V、X113L、X163L、X284A、和X424V；X14V、X26R、X163L、X284A、和X400G；X57F、X163L、X168K、X314N、X315G、X346L、和X398V；X14V、X163L、X173A、X400G、和X420N；X14V、X113L、X163L、和X284A；X14V、X26R、X163L、X284A、和X400G；以及X14V、X33T、X57F、X113L、和X163L。6.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽具有与SEQIDNO:4的多肽相比至少1.2倍增加的稳定性，其中所述工程化多肽中的残基差异是X163I/L/V与选自以下的一个或更多个的组合：X14V；X26R；X31S；X33T；X41L；X88A/L；X284A；X324H；X419S；和X423I。7.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽的序列选自：SEQIDNO:6、8、14、16、22、24、28、30、32、48、52、56、62、64、86、88、90、92、98、100、104、106、108、110、112、114、116、118、120、124、126、128、132、134、136、142、144、148和154。8.如权利要求1所述的工程化多肽，其中所述工程化多肽固定在固体支持物上。9.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述的工程化多肽。10.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求9所述的多核苷酸。11.如权利要求10所述的表达载体，所述表达载体还包含控制序列。12.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求9所述的多核苷酸或权利要求10或11所述的表达载体。13.一种制备工程化多肽的方法，所述方法包括在适合于表达所述工程化多肽的条件下培养权利要求12所述的宿主细胞。14.如权利要求13所述的方法，所述方法还包括分离所述工程化多肽。15.一种用于制备式(I)的化合物的方法，其中R1选自由以下组成的组：氢、羧基、羧基(C1-C6)烷基、任选地取代的(C1-C6)烷基、任选地取代的(C2-C6)烯基、任选地取代的烷氧基羰基、任选地取代的芳基羰基、任选地取代的芳基磺酰基、和保护基团；R2选自由以下组成的组：氢、氧代、卤代、羟基、氨基、硫代、任选地取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)二烷基氨基、(C1-C6)烷基硫代、(C1-C6)烷基磺酰基、(C1-C6)烷基亚磺酰基、和任选地取代的(C1-C6)烷氧基；R4、R6和R7各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、卤代、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、硫代、任选地取代的(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选地取代的(C1-C6)烷氧基、任选地取代的(C1-C6)烷基氨基、任选地取代的(C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的(C1-C6)烷基硫代、任选地取代的(C1-C6)烷基磺酰基、任选地取代的(C1-C6)烷基亚磺酰基、羧基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷基羰基氧基、任选地取代的氨基羰基、氨基羰基(C1-C6)烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的芳氧基、任选地取代的芳基氨基、任选地取代的芳基硫代、任选地取代的芳基磺酰基、任选地取代的芳基亚磺酰基、任选地取代的芳基氧基羰基、任选地取代的芳基羰基氧基、任选地取代的杂芳基氧基、任选地取代的杂芳基氨基、任选地取代的杂芳基硫代、任选地取代的杂芳基磺酰基、任选地取代的杂芳基亚磺酰基、任选地取代的杂芳基氧基羰基、任选地取代的杂芳基羰基氧基、烷基氨基磺酰基(C1-C6)烷基、芳基磺酰基(C1-C6)烷基、和杂芳基磺酰基(C1-C6)烷基；R5选自由以下组成的组：氢、卤代、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、硫代、任选地取代的(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选地取代的(C1-C6)烷氧基、任选地取代的(C1-C6)烷基氨基、任选地取代的(C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的(C1-C6)烷基硫代、任选地取代的(C1-C6)烷基磺酰基、任选地取代的(C1-C6)烷基亚磺酰基、羧基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基羰基、(C1-C6)烷基羰基氧基、任选地取代的氨基羰基、氨基羰基(C1-C6)烷基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、任选地取代的杂芳基、任选地取代的芳氧基、任选地取代的芳基氨基、任选地取代的芳基硫代、任选地取代的芳基磺酰基、任选地取代的芳基亚磺酰基、任选地取代的芳基氧基羰基、任选地取代的芳基羰基氧基、任选地取代的杂芳基氧基、任选地取代的杂芳基氨基、任选地取代的杂芳基硫代、任选地取代的杂芳基磺酰基、任选地取代的杂芳基亚磺酰基、任选地取代的杂芳基氧基羰基、任选地取代的杂芳基羰基氧基、烷基氨基磺酰基(C1-C6)烷基、芳基磺酰基(C1-C6)烷基、和杂芳基磺酰基(C1-C6)烷基、或与R4一起形成5至8元任选地取代的环烷基或任选地取代的杂环；R8选自由以下组成的组：任选地取代的(C1-C6)烷基、任选地取代的(C1-C6)烷氧基、任选地取代的环烷基、任选地取代的杂环烷基、任选地取代的芳基、和任选地取代的杂芳基、或与R2一起形成任选地取代的5至8元环烷基或杂环；以及n是1或2；条件是(a)当R2是氢时，则以下的至少一个适用：(i)R1不是氢、甲基、4-(甲氧基)苯基羰基-、4-(三氟甲氧基)苯磺酰基-、3-溴苯基羰基-、3-氨基丙基、或3-(甲基羰基氨基)丙基-；(ii)R4和R7各自彼此独立地不是氢或氯；(iii)R5不是氢、羟基、甲基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基、或氰基；(iv)R6不是氢、羟基、甲氧基、氟或氯；或(v)R8不是甲基、乙基、羟甲基、或三氟甲基-；以及(b)当n是1，R2和R8一起形成环己基环，并且R1、R4、R6、和R7是氢时，则R5不是氟；所述方法包括在适当的反应条件下在氨基供体的存在下，使式(II)的底物化合物与权利要求1至8的任一项所述的工程化多肽接触，其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8和n如以上所定义。16.如权利要求15所述的方法，其中式(I)的化合物包括在以*标记的碳原子上具有指定的立体化学的式(IS)的化合物，其中化合物(IS)以对映体过量来形成。17.一种用于制备式(Ia)的化合物的方法，其中，R1选自由以下组成的组：氢、羧基、羧基(C1-C6)烷基、任选地取代的(C1-C6)烷基、任选地取代的(C2-C6)烯基、任选地取代的烷氧基羰基、任选地取代的芳基羰基、任选地取代的芳基磺酰基、和保护基团；R2选自由以下组成的组：氢、氧代、卤代、羟基、氨基、硫代、任选地取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基氨基、(C1-C6)二烷基氨基、(C1-C6)烷基硫代、(C1-C6)烷基磺酰基、(C1-C6)烷基亚磺酰基、和任选地取代的(C1-C6)烷氧基；R4、R5、R6和R7各自彼此独立地选自由以下组成的组：氢、卤代、羟基、氨基、羧基、氰基、硝基、硫代、任选地取代的(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、任选地取代的(C1-C6)烷氧基、任选地取代的(C1-C6)烷基氨基、任选地取代的(C1-C6)二烷基氨基、任选地取代的(C1-C6)烷基硫代、任选地取代的(C1-C6)烷基磺酰基、任选地取代的(C1-C6)烷基亚磺酰基、羧基(C1-C6)烷基、(C1-C6...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瓦娜·纳佐尔，德里克·史密斯，迈克尔·A·克罗，宋士玮，史蒂文·J·科利尔，
申请(专利权)人：科德克希思公司，
类型：发明
国别省市：美国;US