制备莱鲍迪苷I的方法以及用途技术

在此描述了制备莱鲍迪苷I、包括高度纯化的莱鲍迪苷I的方法。这些方法利用将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷I的生物催化剂。还提供了包含莱鲍迪苷I的组合物和消费品，包括甜味剂组合物和风味增强组合物。

The preparation method of rebaudioside I and uses thereof

This describes the preparation of rebaudioside I, including methods of highly purified rebaudioside I. These methods use the rebaudioside A into biological catalyst rebaudiodside I. Also provides a rebaudiodside I composition and consumer products, including sweetener composition and flavor enhancing composition.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备莱鲍迪苷I的方法以及用途相关申请的交叉引用本申请要求2014年8月19日提交的美国专利申请号62/039,344的优先权的权益，该专利申请通过引用以其全文结合于此。
本专利技术涉及一种用于制备莱鲍迪苷I的生物催化方法。本专利技术还涉及莱鲍迪苷I作为甜味剂、甜味增强剂和/或风味增强剂的用途。专利技术背景高强度甜味剂具有比蔗糖甜味水平高许多倍的甜味水平。它们基本上无热量，并且普遍用于饮食和低热量产品中，包括食品和饮料。高强度甜味剂不引发升糖反应，从而使得它们适合用于针对糖尿病患者和有兴趣控制其碳水化合物摄入的其他人群的产品中。甜菊醇糖苷是一类在甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)(原产于南美某些地区的菊科(Asteraceae(Compositae))的多年生灌木)叶中发现的化合物。它们的结构特征在于单个碱，甜菊醇，差异在于位置C13和C19上碳水化合物残基的存在。它们在甜叶菊的叶子中积累，构成大约10％-20％的总干重。基于干基，在甜叶菊的叶中发现的4种主要糖苷通常包括甜菊苷(stevioside)(9.1％)、莱鲍迪苷A(3.8％)、莱鲍迪苷C(0.6％-1.0％)和杜克苷A(dulcosideA)(0.3％)。森田化学工业有限公司(MoritaKagakuKogyoCo.，Ltd)的WO2010/03911披露了在某些甜菊品种的叶中发现少量的莱鲍迪苷I。WO2010/03911没有描述分离的莱鲍迪苷I或含有高浓度莱鲍迪苷I的任何组合物的任何感官性质。因此，仍然需要用于制备和纯化莱鲍迪苷I的简单、有效和经济的方法，特别是当这些方法以商业规模可用时。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于制备莱鲍迪苷I组合物的生物催化方法，该方法包括使包含莱鲍迪苷A的起始组合物与能够将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷I的生物催化剂接触。在一个实施例中，生物催化剂是UDP-糖基转移酶(UGT)。适合的UGT包括但不限于UGT76G1或其变体，其中该变体包含与UGT76G1至少约75％的氨基酸序列一致性。在一个具体的实施例中，UGT76G1变体含有一个或多个点突变，与在相同条件下使用未突变的UGT76G1相比，发现这些点突变将莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷A和/或莱鲍迪苷D至莱鲍迪苷M的转化率提高了至少约5％。适合的突变包括但不限于Q266E、P272A、R334K、G348P、L379G、S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A、S456L、I46L、I295M、S119A、S274G、K334R、F314S、K303G、K316R、K393R、I190L、Q425E、Q432E、N138G、V394I、F182L、V407I、A272P、V264C、E449D和A352G。在优选的实施例中，UGT76G1变体选自下组，该组由以下各项组成：UGT76G1-R1-F12、UGT76G1-R2-B9和UGT76G1-R3-G3。生物催化剂可以以任何形式提供，例如像纯形式、粗裂解物或全细胞悬液。在另一个替代实施例中，该生物催化剂以微生物提供。起始组合物可以是纯形式的莱鲍迪苷A、甜菊醇糖苷混合物或甜叶菊提取物。在一个实施例中，起始组合物是含有按重量计至少约1％莱鲍迪苷A的甜菊醇糖苷混合物或甜叶菊提取物。本专利技术的方法提供了包含按重量计至少约1％莱鲍迪苷I的莱鲍迪苷I组合物。该方法典型地在培养基中进行。因此，该方法可以进一步包括从培养基中分离莱鲍迪苷I组合物以提供分离的莱鲍迪苷I组合物。该方法还可以进一步包括纯化步骤，其中将分离的莱鲍迪苷I组合物纯化以提供包含按重量计至少约80％莱鲍迪苷I的高度纯化的莱鲍迪苷I组合物。在一个实施例中，将分离的莱鲍迪苷I组合物纯化以提供纯莱鲍迪苷I，即按重量计>99％。本专利技术还提供纯莱鲍迪苷I。本专利技术还提供了包含莱鲍迪苷I的组合物。在一个实施例中，本专利技术是包含按重量计从约1％至约99％的量的莱鲍迪苷I的组合物。在一个实施例中，本专利技术是包含按重量计至少约80％的莱鲍迪苷I的高度纯化的莱鲍迪苷A组合物。本专利技术还包括使用莱鲍迪苷I作为甜味剂、风味增强剂或甜味增强剂的方法。本专利技术还扩展到包含莱鲍迪苷I的甜味剂组合物、风味增强组合物和甜味增强组合物。还提供了包含莱鲍迪苷I的消费品和包含莱鲍迪苷I的组合物。示例性消费品包括药物组合物、可食用凝胶混合物或组合物、牙科组合物、甜食、调味组合物、口香糖组合物、谷物组合物、烤焙食品、乳制品、以及桌面(tabletop)甜味剂组合物、饮料或饮料产品。附图的简要说明附图被包括在内以提供对本专利技术的进一步理解。这些附图展示了本专利技术的实施例，并且与说明书一起用来解释本专利技术的实施例的原理。图1示出了莱鲍迪苷I的生物催化生产。图2示出了使用酶UGT76G1从甜菊苷生物催化生产莱鲍迪苷A，以及伴随的通过蔗糖合酶进行UDP至UDP-葡萄糖的再循环。图3示出了UGT76G1催化的甜菊苷到莱鲍迪苷A的转化。图4示出了UGT76G1-R1-F12催化的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷I的反应特征曲线。图5示出了用于将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷I的UGT突变体的活性。图6示出了纯化前的莱鲍迪苷I的HPLC迹线。图7示出了在4℃下在水中在400ppm的莱鲍迪苷I与莱鲍迪苷M的感官属性。详细说明制备莱鲍迪苷I的方法本专利技术提供了一种通过使包含莱鲍迪苷A的起始组合物与能够将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷I的生物催化剂接触用于制备莱鲍迪苷I组合物的生物催化方法。莱鲍迪苷I组合物可任选地进一步加工以提供高度纯化的莱鲍迪苷I或甚至纯莱鲍迪苷I。如本文所用，“起始组合物”是指包含莱鲍迪苷A的任何组合物。通常，起始组合物是水溶液。起始组合物可以是纯化的莱鲍迪苷A、甜菊醇糖苷混合物或甜叶菊提取物。含有莱鲍迪苷A的甜菊醇糖苷混合物和甜叶菊提取物、以及高度纯化的莱鲍迪苷A可从各种供应商商购，或可通过文献中提供的方法容易地制备。例如，可口可乐公司(Coca-ColaCompany)的美国专利号8,791,253(其内容通过引用全部并入本文)提供了获得纯度大于95％的莱鲍迪苷A的方法。在一个实施例中，该起始组合物是纯化的莱鲍迪苷A，即按重量计>99％。在另一个实施例中，该起始组合物是一种甜菊醇糖苷混合物。甜菊醇糖苷混合物的身份没有特别限制并且可以包括天然存在的甜菊醇糖苷，例如，甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、杜克苷B、杜克苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O；合成甜菊醇糖苷，例如酶促糖基化甜菊醇糖苷及其组合。在一些实施例中，该起始组合物是甜菊醇糖苷混合物或甜叶菊提取物，该甜菊醇糖苷混合物或甜叶菊提取物包含按重量计约1％或更高，例如像约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约80％或更高或约90％或更高的量的莱鲍迪苷A。在一个具体实施例中，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备莱鲍迪苷I组合物的方法，包括：a.使包含莱鲍迪苷A的起始组合物与能够将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷I的生物催化剂接触以提供包含莱鲍迪苷I的组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.19 US 62/039,3441.一种制备莱鲍迪苷I组合物的方法，包括：a.使包含莱鲍迪苷A的起始组合物与能够将莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷I的生物催化剂接触以提供包含莱鲍迪苷I的组合物。2.如权利要求1所述的方法，其中该生物催化剂是UDP-糖基转移酶(UGT)。3.如权利要求2所述的方法，其中该UGT是UGT76G1或其含有约75％氨基酸序列一致性或更高一致性的变体。4.如权利要求3所述的方法，其中该UGT76G1变体选自下组，该组由以下各项组成：UGT76G1-R1-F12、UGT76G1-R2-B9和UGT76G1-R3-G3。5.如权利要求3所述的方法，其中该UGT76G1变体包括一个或多个以下点突变：Q266E、P272A、R334K、G348P、L379G、S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A、S456L、I46L、I295M、S119A、S274G、K334R、F314S、K303G、K316R、K393R、I190L、Q425E、Q432E、N138G、V394I、F182L、V407I、A272P、V264C、E449D和A352G。6.如权利要求5所述的方法，其中该UGT变体含有以下点突变：Q266E、P272A、R334K、G348P和L379G。7.如权利要求5所述的方法，其中该UGT变体含有以下点突变：Q266E、P272A、R334K、G348P、L379G、S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A和S456L。8.如权利要求5所述的方法，其中该UGT变体含有以下点突变：Q266E、P272A、R334K、G348P、L379G、S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A、S456L、I46L、I295M、S119A、S274G、K334R、F314S、K303G、K316R、K393R、I190L、Q425E、Q432E、N138G、V394I、F182L、V407I、A272P、V264C、E449D和A352G。9.如权利要求2-8中任一项所述的方法，其中该UGT以选自纯化的、粗裂解物或全细胞悬液的形式提供。10.如权利要求2-8中任一项所述的方法，其中该UGT以微生物提供。11.如权利要求1所述的方法，其中莱鲍迪苷A以纯形式提供。12.如权利要求1所述的方法，其中莱鲍迪苷A以含有按重量计至少约1％的莱鲍迪苷A的甜菊醇糖苷混合物或甜叶菊提取物提供。13.如权利要求12所述的方法，其中莱鲍迪苷A以含有按重量计至少约80％的莱鲍迪苷A的甜菊醇糖苷混合物或甜叶菊提取物提供。14.如权利要求1所述的方法，其中该莱鲍迪苷I组合物包含按重量计大于约1％的莱鲍迪苷I。15.如权利要求1所述的方法，进一步包括分离莱鲍迪苷I以提供分离的莱鲍迪苷I组合物。16.如权利要求15所述的方法，进一步包括纯化所分离的莱鲍迪苷I组合物以提供高度纯化的莱鲍迪苷I。17.如权利要求15所述的方法，进一步包括纯化所分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：因德拉·普拉卡什，辛西娅·邦德斯，阿韦季克·马尔科相·马尔科相，西里尔·加林，罗伯特·特尔·哈雷，
申请(专利权)人：可口可乐公司，谱赛科有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US