甜菊糖苷的重组生产制造技术

本发明专利技术涉及甜菊糖苷的重组生产，公开了经过改造能够表达编码甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶(UGTs)的新型重组基因的重组微生物、植物和植物细胞。这些微生物、植物或植物细胞可以产生甜菊醇或甜菊糖苷(例如甜叶悬钩子苷或莱鲍迪苷A)，作为食品中的天然甜味剂和膳食补充剂。

【技术实现步骤摘要】
本申请是中国专利申请CN201180038475.4的分案申请，原申请是国际申请号PCT/US2011/038967于2013年2月4日进入中国国家阶段的申请。序列表本申请含有以ASCII格式经EFS-Web提交的序列表，该序列表通过引用全部并入本文。所述2011年6月2日生成的ASCII拷贝命名为25933WO1.txt，大小为483,406字节。
本公开涉及甜菊醇(steviol)和甜菊糖苷(steviolglycoside)的重组制备。具体来说，本公开涉及通过诸如重组微生物、植物或植物细胞的重组宿主制备甜菊醇和甜菊糖苷，比如甜叶悬钩子苷(rubusoside)和/或莱鲍迪苷(rebaudioside)A。本公开还提供了含有所述甜菊糖苷的组合物。
技术介绍
甜味剂是常用于食品、饮料或糖果业的为人熟知的成分。甜味剂既可以用于在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂或者作为烘培中糖的家用替代品来单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(比如蔗糖、高果糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(比如阿斯巴甜、糖精和蔗糖素)。甜菊提取物是可以从常青灌木甜叶菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的一种天然甜味剂。甜菊在南美和亚洲被广泛种植用于商业生产甜菊提取物。纯化程度各不相同的甜菊提取物常常被作为食品中的高甜度甜味剂，或者混合或单独作为佐餐甜味剂。甜菊植物的提取物含有莱鲍迪苷和其它带来甜味的甜菊糖苷，虽然不同产品批次之间每种糖苷的量往往不同。现有的商品中占优势的是莱鲍迪苷A，和量少一些的其它糖苷，比如莱鲍迪苷C、D和F。甜菊提取物还可能含有杂质，比如造成异味的来源于植物的化合物。这些异味根据食物系统或者目标用途会带来或多或少的问题。潜在的杂质包括色素、脂类、蛋白、酚类、糖类、斯巴醇和其它倍半萜烯、半日花烷型二萜类、单萜烯、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆甾醇、β-谷甾醇、α-和β-香树素、羽扇豆醇酯、β-香树脂醇乙酸乙酯、五环三萜、centauredin、quercitin、epi-α-杜松醇、carophyllenes和衍生物、β-松油萜、β-谷甾醇和赤霉素。
技术实现思路
本文提供了诸如微生物的重组宿主，所述重组宿主包含一或多个生物合成基因，这些基因的表达导致甜菊醇的产生。这类基因包括编码柯巴基焦磷酸合酶的基因、编码异贝壳杉烯合酶的基因、编码异贝壳杉烯氧化酶的基因，和编码甜菊醇合成酶的基因。重组宿主可以包含编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因代替编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因。这些基因中至少一个是重组基因。在一些实施方案中，重组宿主还包含编码香叶基香叶基(geranylgeranyl)焦磷酸合酶的基因。重组宿主还可以包含编码截短的HMG-CoA还原酶的基因和/或编码CPR的基因。这些基因中一或多个的表达可以是诱导性的。本文本一个方面提供了重组宿主，所述重组宿主包含编码UGT91D2多肽(例如UGT91D2e或UGT91D2m多肽)的重组基因。UGT91D2多肽与SEQIDNO：5中给出的氨基酸序列可以有至少90％的同一性(例如，至少95％或99％同一性)。UGT91D2多肽可以包含位于SEQIDNO：5的残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。例如，UGT91D2多肽包含位于选自SEQIDNO：5的残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438中的一或多个残基的氨基酸取代。在一个实施方案中，UGT91D2多肽包含相对SEQIDNO：5位于残基位点206的精氨酸、残基位点207的半胱氨酸。在一个实施方案中，UGT91D2多肽包含相对SEQIDNO：5位于残基位点30的苯丙氨酸、残基位点93的谷氨酰胺、残基位点99的缬氨酸、残基位点122的苯丙氨酸、残基位点140的酪氨酸、残基位点142的半胱氨酸、残基位点148的苏氨酸、残基位点153的丙氨酸、残基位点156的丝氨酸、残基位点195的甲硫氨酸、残基位点196的谷氨酸、残基位点199的谷氨酸、残基位点211的甲硫氨酸、残基位点221的苯丙氨酸、残基位点286的丙氨酸、残基位点427的天冬酰胺或者残基位点438的丙氨酸。多肽可以具有SEQIDNO：5或SEQIDNO：95的氨基酸序列。本文描述的宿主还包含编码与SEQIDNO：3给出的氨基酸序列有至少90％同一性的UGT85C多肽的重组基因。例如，UGT85C多肽可以包含位于SEQIDNO：3的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。本文描述的宿主还包含编码与SEQIDNO：7给出的氨基酸序列有至少90％同一性的UGT76G多肽的重组基因。例如，UGT76G多肽可以包含位于SEQIDNO：7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代。本文本还提供了包含重组基因的重组宿主，所述重组基因编码的UGT85C多肽与SEQIDNO：3中给出的氨基酸序列有至少90％同一性，并且有位于SEQIDNO：3中的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。例如，UGT85C多肽可以包含位于SEQIDNO：3的残基13、15、60、270、289和418的取代。例如，UGT85C多肽可以包含a)位于SEQIDNO：3的残基13、60和270的取代；b)位于SEQIDNO：3的残基60和87的取代；c)位于SEQIDNO：3的残基65、71、220、243和270的取代；d)位于SEQIDNO：3的残基65、71、220、243、270和441的取代；e)位于SEQIDNO：3的残基65、71本文档来自技高网...

【技术保护点】
给甜菊糖苷中的葡萄糖的C‑2′转移第二糖部分的方法，所述方法包括将甜菊糖苷与UGT91D2多肽和UDP‑糖在适合第二糖部分转移到所述甜菊糖苷上的反应条件下进行接触。

【技术特征摘要】
2010.06.02 US 61/350,553;2011.01.20 US 61/434,582;1.给甜菊糖苷中的葡萄糖的C-2′转移第二糖部分的方法，所述方法包括将甜菊糖苷与
UGT91D2多肽和UDP-糖在适合第二糖部分转移到所述甜菊糖苷上的反应条件下进行接触。
2.权利要求1所述的方法，其中所述UGT91D2多肽包含具有以下的多肽：
(a)与SEQIDNO：5给出的氨基酸序列有至少90％同一性；
(b)具有位于SEQIDNO：5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-
202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代；或
(c)具有位于SEQIDNO：5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、
199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基的氨基酸取代。
3.权利要求1所述的方法，其中所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子
苷、甜菊苷或莱鲍迪苷A。
4.权利要求3所述的方法，其中：
(a)所述甜菊糖苷是甜叶悬钩子苷，所述第二糖部分是葡萄糖，并且在转移了所述第二
葡萄糖部分时产生甜菊苷；
(b)所述甜菊糖苷是甜菊苷，所述第二糖部分是葡萄糖，并且在转移了所述第二葡萄糖
部分时产生莱鲍迪苷E；
(c)所述甜菊糖苷是甜菊苷，甜菊苷与所述UGT91D2多肽和UGT76G1多肽在所述合适的
反应条件下进行接触以产生莱鲍迪苷D；
(d)所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷，并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产
生甜菊醇-1，2二糖苷；
(e)所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷，并且在转移了所述第二糖部分时产生甜
菊醇-1，2-木二糖苷；
(f)所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷，并且在转移了所述第二糖部分时产生甜
菊醇-1，2-鼠李二糖苷；
(g)所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷A，并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷D。
5.权利要求1的方法，其中所述体外方法是酶促体外方法或者全细胞体外方法。
6.权利要求5的方法，其中所述全细胞体外方法的细胞是酵母细胞、植物细胞、哺乳动
物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或者细菌细胞。
7.能够在细胞液体培养基中生产甜菊糖苷组合物的重组宿主细胞，其包含：
(a)编码能够对甜菊糖苷的13-O-葡萄糖的C2’进行β1，2葡糖基化之多肽的基因；
其中所述多肽将额外的糖部分转移到所述甜菊糖苷中葡萄糖的C2’；
(b)编码能够对甜菊糖苷的19-O-葡萄糖的C2’进行β1，2葡糖基化之多肽的基因；
其中所述多肽将额外的糖部分转移到所述甜菊糖苷中葡萄糖的C2’；和/或
(c)编码能够对甜菊糖苷的13-O-葡萄糖的C3’进行β1，3葡糖基化之多肽的基因；
其中所述基因至少之一是重组基因；
其中所述甜菊糖苷包括甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或者莱鲍迪苷
A；并且
其中所述甜菊糖苷组合物包含甜菊苷、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷D、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜
菊醇-1，2-木二糖苷和/或甜菊醇-1，2-鼠李二糖苷。
8.鉴定多态性是否与性状差别关联的方法，所述方法包括：
a)确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQIDNO：5中给出的多肽及其功能
同源物的基因座关联；和
b)测量所述群体中的植物的性状差别与所述群体中的植物是否存在所述一或多个基
因多态性之间的相关性，从而确认所述一或多个基因多态性是否与所述性状的差别关联。
9.分离的核酸：
(a)其编码包括以下的多肽：
(i)多肽，其包含位于SEQIDNO：5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-
184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代；或
(ii)多肽，其包含位于SEQIDNO：5中选自残基30、93、99、122、140、142、144、148、153、
156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基的氨基酸取代；或
(iii)多肽，其包含在SEQIDNO：5的残基206的精氨酸，残基207的半胱氨酸和残基343
的精氨酸；或
(iv)多肽，其包...

【专利技术属性】
技术研发人员：GM基肖尔，M莫申，PM希克斯，J汉森，J霍顿拉森，EH汉森，MD米克尔森，S塔瓦雷斯，C布洛姆，
申请(专利权)人：沃维公司，
类型：发明
国别省市：美国;US