用于提高莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M之产生的方法技术

本发明专利技术提供了用于重组产生甜菊醇糖苷的方法和包含甜菊醇糖苷的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于提高莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M之产生的方法
本文中公开的本专利技术一般地涉及重组产生甜菊醇糖苷(steviolglycoside)的领域。特别地，本专利技术提供了用于重组产生甜菊醇糖苷的方法和包含甜菊醇糖苷的组合物。
技术介绍
甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的。甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下或作为佐餐甜味剂(tabletopsweeter)单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯帕坦、糖精和三氯半乳蔗糖(sucralose))。甜菊提取物(steviaextract)是可从多年生灌木甜菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于商业生产甜菊提取物。纯化程度各不相同的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及在共混物中或单独地作为佐餐甜味剂。甜菊属植物的提取物含有莱鲍迪苷(Rebaudioside)和其他带来甜味的甜菊醇糖苷，但不同生产批次之间每种糖苷的量往往不同。现有的商业化产品中主要是莱鲍迪苷A，和量少一些的其他糖苷，例如莱鲍迪苷C、D和F。甜菊提取物还可含有污染物，例如造成异味或具有其他不期望影响的来自植物的化合物。这些污染物根据食物系统或应用选择可带来或多或少的问题。潜在的污染物包括：色素、脂质、蛋白质、酚类、糖类、斯巴醇和其他倍半萜、半日花烷型二萜(labdanediterpene)、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆甾醇、β-谷甾醇、α-香树素和β-香树素、羽扇豆醇、β-香树醇乙酸酯(β-amryinacetate)、五环三萜、矢车菊黄素(centauredin)、槲皮素、表-α-杜松醇(epi-alpha-cadinol)、石竹烯(carophyllene)及衍生物、β-蒎烯(beta-pinene)、β-谷甾醇、以及赤霉素(gibberellin)。由于已经证明从甜菊属植物中回收和纯化甜菊醇糖苷是劳动密集且低效的，依然需要可产生高产率的具有较少的基于植物之污染物(包括但不限于甜菊苷(stevioside))的期望的甜菊醇糖苷(例如莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M)的重组产生系统。产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株以及生物转化和体外生物合成描述在PCT申请No.PCT/US2012/050021和PCT/US2011/038967中，其通过引用整体并入本文。本质上，甜菊属尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶76G1(uridinediphosphatedependentglycosyltransferase76G1，UGT76G1)催化甜菊醇骨架上的多个糖基化反应，这导致产生甜菊醇糖苷。最近，已经表明UGT76G1可将1，2-甜菊苷转化成莱鲍迪苷A以及将1，2-二糖苷(1，2-bioside)转化成莱鲍迪苷B(参见Richman等，2005，ThePlantJournal41：56-67)。因此，本领域中需要鉴定针对通过UGT76G1或其他UGT酶产生糖基化莱鲍迪苷的反应。特别地，需要探索或鉴定通过UGT76G1催化的其他反应以及需要提高UGT76G1的催化能力以产生更高产率的甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M。专利技术概述在上述背景下，本专利技术提供了超过现有技术的某些优点和改进。特别地，本专利技术涉及由遗传修饰细胞生物合成莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M以及莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M制备物。在一些特定实施方案中，本专利技术涉及来自遗传修饰细胞的具有显著改进的生物合成速率和产率的莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M制备物。本公开内容涉及甜菊醇糖苷的产生。特别地，本公开内容涉及通过但不限于重组宿主(例如重组微生物)、通过生物转化以及体外产生甜菊醇糖苷，其包括莱鲍迪苷M：(1R，5R，9S，13R)-13-{[(2S，3R，4S，5R，6R)-5-羟基-6-(羟甲基)-3，4-双({[(2S，3R，4S，5S，6R)-3，4，5-三羟基-6-(羟甲基)氧杂环己烷-2-基]氧基})氧杂环己烷-2-基]氧基}-5，9-二甲基-14-亚甲基四环[11.2.1.01，10.04，9]十六烷-5-羧酸(2S，3R，4S，5R，6R)-5-羟基-6-(羟甲基)-3，4-双({[(2S，3R，4S，5S，6R)-3，4，5-三羟基-6-(羟甲基)氧杂环己烷-2-基]氧基})氧杂环己烷-2-基酯以及莱鲍迪苷D：13-{[5-羟基-6-(羟甲基)-3，4-双({[3，4，5-三羟基-6-(羟甲基)氧杂环己烷-2-基]氧基})氧杂环己烷-2-基]氧基}-5，9-二甲基-14-亚甲基四环[11.2.1.01，10.04，9]十六烷-5-羧酸4，5-二羟基-6-(羟甲基)-3-{[3，4，5-三羟基-6-(羟甲基)氧杂环己烷-2-基]氧基}氧杂环己烷-2-基酯因此，在一个方面，本公开内容提供了重组宿主(例如微生物)，其包含一种或更多种生物合成基因，其中一种或更多种生物合成基因的表达导致产生甜菊醇糖苷，包括莱鲍迪苷M和莱鲍迪苷D。特别地，一种或更多种本文中所述尿苷5′-二磷酸(UDP)糖基转移酶(例如EUGT11、UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2和UGT91D2)的表达有助于重组宿主或某些体外系统中莱鲍迪苷M或莱鲍迪苷D的产生和积累。尽管本文中公开的本专利技术不限于特定优点或功能，本专利技术提供了包含约1％至约99％w/w莱鲍迪苷M的组合物，其中所述组合物具有相对于甜菊提取物降低水平的来自甜菊的污染物，其中至少一种所述污染物是来自植物的化合物。在某些情况下，所述来自植物的污染性化合物尤其可造成异味。在一些方面，包含约1％至约99％w/w莱鲍迪苷M的组合物具有相对于甜菊提取物少于0.1％的来自甜菊的污染物，其中至少一种所述污染物是来自植物的化合物。在某些情况下，所述来自植物的污染性化合物尤其可造成异味。本专利技术还提供了包含上述组合物的食品。在一些方面，所述食品是饮料或饮料浓缩物。本专利技术还提供了重组宿主细胞，其表达：(a)编码GGPPS的重组基因；(b)编码内部柯巴基二磷酸合酶(ent-copalyldiphosphatesynthase，CDPS)多肽的重组基因；(c)编码贝壳杉烯氧化酶(kaureneoxidase，KO)多肽的重组基因；(d)编码贝壳杉烯合酶(kaurenesynthase，KS)多肽的重组基因；(e)编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的重组基因；(f)编码细胞色素P450还原酶(cytochromeP450reductase，CPR)多肽的重组基因；(g)编码UGT85C2多肽的重组基因；(h)编码UGT74G1多肽的重组基因；(i)编码UGT76G1多肽的重组基因；(j)编码UGT91d2多肽的重组基因；以及(k)编码EUGT11多肽的重组基因；其中至少一种所述基因是重组基因，并且其中所述细胞产生莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷Q和/或莱鲍迪苷I。本专利技术还提供了重组宿主细胞，其包含含有以下的外源核酸：(a)编码GGPPS的重组基因；(b)编码内部柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合物，其包含约1％至约99％w/w莱鲍迪苷M，其中所述组合物与甜菊提取物相比，来自甜菊的污染物的水平降低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.02.06 US 61/761,490;2013.10.03 US 61/886,4421.在以下基因表达的条件下能够在细胞培养物中产生甜菊醇糖苷组合物的重组宿主细胞，其包含：(a)编码能够从法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯基二磷酸(IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)之多肽的基因；(b)编码能够从GGPP合成内部柯巴基二磷酸之多肽的基因；(c)编码能够从内部柯巴基焦磷酸合成内部-贝壳杉烯之多肽的基因；(d)编码能够从内部-贝壳杉烯合成内部-异贝壳杉烯酸之多肽的基因；(e)编码能够从内部-异贝壳杉烯酸合成甜菊醇之多肽的基因；(f)编码能够还原细胞色素P450复合物之多肽的基因；(g)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’位β-1，2糖基化之第一多肽的第一基因；其中所述基因具有两个或更多个拷贝数；并且其中所述第一多肽为SEQIDNO：16所示氨基酸序列；以及编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’位β-1，2糖基化之第二多肽的第二基因；其中所述第二多肽为SEQIDNO：15、66或86中任一所示氨基酸序列；(h)编码能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’位β-1，3糖基化之多肽的基因；(i)编码能够在甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-13羟基处将其糖基化之多肽的基因；以及(j)编码能够在甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基处将其糖基化之多肽的基因；其中至少一种所述基因是重组基因；其中所述甜菊醇糖苷包含甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、覆盆子苷、甜菊苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E；其中由所述宿主细胞产生的所述甜菊醇糖苷组合物包含由所述宿主细胞以至少600mg/L细胞培养物的浓度产生的莱鲍迪苷M；其中所述重组宿主细胞包括昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞；并且其中所述重组宿主不是植物和/或植物细胞。2.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中：(a)所述能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’位β-1，3糖基化的多肽为SEQIDNO：2所示氨基酸序列；(b)所述能够在甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-13羟基处将其糖基化的多肽为SEQIDNO：26所示氨基酸序列；以及(c)所述能够在甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基处将其糖基化的多肽为SEQIDNO：19所示氨基酸序列；其中至少一种所述多肽是重组多肽。3.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中：(a)所述能够从法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯基二磷酸(IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的多肽为SEQIDNO：24所示氨基酸序列；(b)所述能够从GGPP合成内部柯巴基二磷酸的多肽为SEQIDNO：13所示氨基酸序列；(c)所述能够从内部柯巴基焦磷酸合成内部-贝壳杉烯的多肽为SEQIDNO：21所示氨基酸序列；(d)所述能够从内部-贝壳杉烯合成内部-异贝壳杉烯酸的多肽为SEQIDNO：25所示氨基酸序列；(e)所述能够从内部-异贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽为SEQIDNO：11所示氨基酸序列；和/或(f)所述能够还原细胞色素P450复合物的多肽为SEQIDNO：4或9中任一所示氨基酸序列。4.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述甜菊醇糖苷组合物还包含由所述宿主细胞产生的莱鲍迪苷D；其中由所述宿主细胞产生的莱鲍迪苷M和莱鲍迪苷D以1∶0.1至0.1∶1的比例存在于所述细胞培养物中。5.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞以至少1000mg/L细胞培养物的浓度产生莱鲍迪苷M。6.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还以至少1000mg/L细胞培养物的浓度产生莱鲍迪苷D。7.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的所述甜菊醇糖苷组合物还包含由所述宿主细胞产生的莱鲍迪苷D。8.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的所述甜菊醇糖苷组合物还包含由所述宿主细胞以至少600mg/L细胞培养物的浓度产生的莱鲍迪苷D。9.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的所述甜菊醇糖苷组合物包含由所述宿主细胞在所述细胞培养物中以至少1∶0.1的比例产生的莱鲍迪苷M和莱鲍迪苷D。10.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中由所述宿主细胞产生的所述甜菊醇糖苷组合物包含由所述宿主细胞在所述细胞培养物中以至少1∶0.1的比例产生的莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M。11.权利要求10所述的重组宿主细胞，其中所述真菌细胞包括酵母细胞。12.权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnerajadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、博伊丁念珠菌(Candidaboidinii)、Arxulaadeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)或白色念珠菌(Candidaalbicans)物种的细胞。13.权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞为酵母纲。14.权利要求13所述的重组宿主细胞，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。15.权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是解脂耶氏酵母细胞。16.在细胞培养物中产生甜菊醇糖苷组合物的方法，其包括在以下基因表达的条件下培养包含以下基因的重组宿主细胞：(a)编码能够从法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯基二磷酸(IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)之多肽的基因；(b)编码能够从GGPP合成内部柯巴基二磷酸之多肽的基因；(c)编码能够从内部柯巴基焦磷酸合成内部-贝壳杉烯之多肽的基因；(d)编码能够从内部-贝壳杉烯合成内部-异贝壳杉烯酸之多肽的基因；(e)编码能够从内部-异贝壳杉烯酸合成甜菊醇之多肽的基因；(f)编码能够还原细胞色素P450复合物之多肽的基因；(g)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’位β-1，2糖基化之第一多肽的第一基因；其中所述基因具有两个或更多个拷贝数；并且其中所述第一多肽为SEQIDNO：16所示氨基酸序列；以及编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C2’位β-1，2糖基化之第二多肽的第二基因；其中所述第二多肽为SEQIDNO：15、66或86中任一所示氨基酸序列；(h)编码能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’位β-1，3糖基化之多肽的基因；(i)编码能够在甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-13羟基处将其糖基化之多肽的基因；以及(j)编码能够在甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基处将其糖基化之多肽的基因；其中至少一种所述基因是重组基因；其中所述甜菊醇糖苷包含甜菊醇-13-O-葡糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷、覆盆子苷、甜菊苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E；其中由所述宿主细胞产生的所述甜菊醇糖苷组合物包含由所述宿主细胞以至少600mg/L细胞培养物的浓度产生的莱鲍迪苷M；并且所述方法还包括分离由所述宿主细胞从所述细胞培养物产生的莱鲍迪苷M。17.权利要求16所述的方法，其中组成性地表达所述一种或更多种基因。18.权利要求16所述的方法，其中诱导所述一种或更多种基因表达。19.权利要求16至18中任一项所述的方法，其中：(a)所述能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖二者的C3’位β-1，3糖基化的多肽为SEQIDNO：2所示氨基酸序列；(b)所述能够在甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-13羟基处将其糖基化的多肽为SEQIDNO：26所示氨基酸序列；以及(c)所述能够在甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基处将其糖基化的多肽为SEQIDNO：19所示氨基酸序列；其中至少一种所述多肽是重组多肽。20.权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物还包含葡萄糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、N-乙酰基-葡糖胺和/或酵母氮碱(YNB)。21.权利要求16至18中任一项所述的方法，其中：(a)所述能够从法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯基二磷酸(IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的多肽为SEQIDNO：24所示氨基酸序列；(b)所述能够从GGPP合成内部柯巴基二磷酸的多肽为SEQIDNO：13所示氨基酸序列；(c)所述能够从内部柯巴基焦磷酸合成内部-贝壳杉烯的多肽为SEQIDNO：21所示氨基酸序列；(d)所述能够从内部-贝壳杉烯合成内部-异贝壳杉烯酸的多肽为SEQIDNO：25所示氨基酸序列；(e)所述能够从内部-异贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽为SEQIDNO：11所示氨基酸序列；和/或(f)所述能够还原细胞色素P450复合物的多肽为SEQIDNO：4或9中任一所示氨基酸序列。22.权利要求16所述的方法，其中所述分离步骤包括：(a)分离所述细胞培养物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·达尔埃格德·米克尔森，约恩·汉森，埃内斯托·西蒙，费代里科·布里安扎，安格利卡·塞姆莱尔，基姆·奥尔森，西蒙·卡尔森，路易斯·迪林，阿列克谢·乌斯片斯基，保拉·希克斯，
申请(专利权)人：埃沃尔瓦公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH