【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在重组宿主中生产甜菊醇糖苷专利技术背景专利
本公开涉及甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体在重组宿主中的重组生产。具体地，本公开涉及在重组宿主中生产甜菊醇糖苷，包括甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊醇糖苷、1，3-甜菊醇糖苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷C(RebC)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷M(RebM)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜尔可苷A、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷或它们的异构体。相关技术描述抗损伤蛋白1(DAP1)是细胞色素b5相关蛋白，其结合血红素并在细胞色素P450(P450)催化周期中执行尚未表征的功能。DAP1与来自几个不同家族的P450的相互作用表明在P450的调控中的一般作用，而人、植物、蝇类和蠕虫中同源物的存在表明该功能在真核生物中的广泛保守性。参见Mall...
【技术保护点】
1.一种能够在细胞培养物中生产一种或多种甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的重组宿主细胞，其包含编码与SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的抗损伤蛋白1(DAP1)多肽的重组基因；其中编码DAP1多肽的所述重组基因的表达导致所述细胞培养物中所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的产量增加。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.11 US 62/306,9871.一种能够在细胞培养物中生产一种或多种甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的重组宿主细胞，其包含编码与SEQIDNO：2中列出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的抗损伤蛋白1(DAP1)多肽的重组基因；其中编码DAP1多肽的所述重组基因的表达导致所述细胞培养物中所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的产量增加。2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，还包含：(a)编码能够由法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的多肽的基因；(b)编码能够由GGPP合成对映柯巴基二磷酸的多肽的基因；(c)编码能够由对映柯巴基焦磷酸合成对映贝壳杉烯的多肽的基因；(d)编码能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基上糖基化的多肽的基因；(e)编码能够实现甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’的β1，3糖基化的多肽的基因；(f)编码能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基上糖基化的多肽的基因；和/或(g)编码能够实现甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’的β1，2糖基化的多肽的基因；以及(h)编码能够由对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸、对映贝壳杉烯醇和/或对映贝壳杉烯醛的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：60、SEQIDNO：62、SEQIDNO：117、SEQIDNO：66、SEQIDNO：68、SEQIDNO：70、SEQIDNO：72、SEQIDNO：74或SEQIDNO：76中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；以及(i)编码能够由对映贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：94、SEQIDNO：97、SEQIDNO：100、SEQIDNO：101、SEQIDNO：102、SEQIDNO：103、SEQIDNO：104、SEQIDNO：106、SEQIDNO：108、SEQIDNO：110、SEQIDNO：112或SEQIDNO：114中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；以及(j)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：78、SEQIDNO：80、SEQIDNO：82、SEQIDNO：84、SEQIDNO：86、SEQIDNO：88、SEQIDNO：90、SEQIDNO：92中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；并且任选地，其中编码DAP1多肽的所述重组基因相对于缺乏所述重组基因的相应宿主细胞过表达。3.如权利要求1所述的重组宿主细胞，还包含：(a)编码能够由法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：20、SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：26、SEQIDNO：28、SEQIDNO：30、SEQIDNO：32或SEQIDNO：116中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；(b)编码能够由GGPP合成对映柯巴基二磷酸的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：34、SEQIDNO：36、SEQIDNO：38、SEQIDNO：40或SEQIDNO：42中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(c)编码能够由对映柯巴基焦磷酸合成对映贝壳杉烯的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：44、SEQIDNO：46、SEQIDNO：48、SEQIDNO：50或SEQIDNO：52中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(d)编码能够由对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸、对映贝壳杉烯醇和/或对映贝壳杉烯醛的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：60、SEQIDNO：62、SEQIDNO：117、SEQIDNO：66、SEQIDNO：68、SEQIDNO：70、SEQIDNO：72、SEQIDNO：74或SEQIDNO：76中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(e)编码能够由对映贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：94、SEQIDNO：97、SEQIDNO：100、SEQIDNO：101、SEQIDNO：102、SEQIDNO：103、SEQIDNO：104、SEQIDNO：106、SEQIDNO：108、SEQIDNO：110、SEQIDNO：112或SEQIDNO：114中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(f)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：78、SEQIDNO：80、SEQIDNO：82、SEQIDNO：84、SEQIDNO：86、SEQIDNO：88、SEQIDNO：90、SEQIDNO：92中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(g)编码能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基上糖基化的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：7中列出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；(h)编码能够实现甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’的β1，3糖基化的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：9中列出的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；(i)编码能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基上糖基化的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：4中列出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或(j)编码能够实现甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’的β1，2糖基化的多肽的基因；其中所述多肽包含与SEQIDNO：11或13中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或与SEQIDNO：16中列出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；其中所述基因中的至少一个是重组基因。4.如权利要求1-3中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷是以下各项，或所述甜菊醇糖苷组合物包含以下各项：甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、1，2-甜菊醇糖苷、1，3-甜菊醇糖苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷C(RebC)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷M(RebM)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜尔可苷A、和/或它们的异构体。5.如权利要求1-4中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。6.一种在细胞培养物中生产一种或多种甜菊醇糖苷的方法，其包括在所述基因表达的条件下使权利要求1-5中任一项所述的重组宿主细胞在所述细胞培养物中生长，并且其中所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物由所述重组宿主细胞生产。7.如权利要求6所述的方法，其中所述基因组成型表达和/或诱导所述基因的表达。8.如权利要求6或7所述的方法，其中使所述重组宿主细胞在发酵罐中在一定的温度下生长一定的时间段，其中所述温度和所述时间段有利于所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的生产。9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，还包括从所述细胞培养物中分离所生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物。10.如权利要求9所述的方法，其中所述分离步骤包括：(a)提供包含所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的所述细胞培养物；(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分开，以获得包含所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的上清液；(c)提供一种或多种吸附树脂，包括在填充柱中提供所述吸附树脂；以及(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种吸附树脂接触，以便获得所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的至少一部分，从而分离所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物；或(a)提供包含所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的所述细胞培养物；(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分开，以获得包含所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的上清液；(c)提供一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱；以及(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱接触，以便获得所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的至少一部分，从而分离所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物；或(a)提供包含所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的所述细胞培养物；(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分开，以获得包含所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的上清液；(c)结晶或提取所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物，从而分离所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物。11.如权利要求6-8中任一项所述的方法，还包括从所述细胞培养物中回收所述生产的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物。12.如权利要求11所述的方法，其中所述回收的一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。13.一种用于生产一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的方法，包括使用以下各项在重组宿主细胞的细胞培养基中对植物来源的或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷进行全细胞生物转化：(a)与SEQIDNO：2中列出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的DAP1多肽；(b)能够由法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的多肽；(c)能够由GGPP合成对映柯巴基二磷酸的多肽；(d)能够由对映柯巴基焦磷酸合成对映贝壳杉烯的多肽；(e)能够由对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸、对映贝壳杉烯酸醇和/或对映贝壳杉烯醛且与SEQIDNO：60、SEQIDNO：62、SEQIDNO：117、SEQIDNO：66、SEQIDNO：68、SEQIDNO：70、SEQIDNO：72、SEQIDNO：74或SEQIDNO：76中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(f)能够由对映贝壳杉烯酸合成甜菊醇且与SEQIDNO：94、SEQIDNO：97、SEQIDNO：100、SEQIDNO：101、SEQIDNO：102、SEQIDNO：103、SEQIDNO：104、SEQIDNO：106、SEQIDNO：108、SEQIDNO：110、SEQIDNO：112或SEQIDNO：114中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(g)能够还原细胞色素P450复合物且与SEQIDNO：78、SEQIDNO：80、SEQIDNO：82、SEQIDNO：84、SEQIDNO：86、SEQIDNO：88、SEQIDNO：90、SEQIDNO：92中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(h)能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基上糖基化的多肽；(i)能够实现甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’的β1，3糖基化的多肽；(j)能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基上糖基化的多肽；和/或(k)能够实现甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’的β1，2糖基化的多肽；其中至少一种所述多肽是在所述重组宿主细胞中表达的重组多肽；以及从而产生所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物。14.如权利要求13所述的方法，其中：(a)能够由法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的所述多肽包括与SEQIDNO：20、SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：26、SEQIDNO：28、SEQIDNO：30、SEQIDNO：32或SEQIDNO：116中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；(b)能够由GGPP合成对映柯巴基二磷酸的所述多肽包括与SEQIDNO：34、SEQIDNO：36、SEQIDNO：38、SEQIDNO：40或SEQIDNO：42中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(c)能够由对映柯巴基焦磷酸合成对映贝壳杉烯的所述多肽包括与SEQIDNO：44、SEQIDNO：46、SEQIDNO：48、SEQIDNO：50或SEQIDNO：52中列出的氨基酸序列中的一个具有至少70％序列同一性的多肽；(d)能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基上糖基化的所述多肽包括与SEQIDNO：7中列出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；(e)能够实现甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’的β1，3糖基化的所述多肽包括与SEQIDNO：9中列出的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；(f)能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基上糖基化的所述多肽包括与SEQIDNO：4中列出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或(g)能够实现甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’的β1，2糖基化的多肽包括与SEQIDNO：11或13中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或与SEQIDNO：16中列出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。15.如权利要求6-14中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。16.一种用于生产一种或多种甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的体外方法，包括将以下各项以及植物来源的或合成的甜菊醇糖苷前体添加到反应混合物中：(a)与SEQIDNO：2中列出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的重组DAP1多肽；(b)能够由法尼基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的多肽；(c)能够由GGPP合成对映柯巴基二磷酸的多肽；(d)能够由对映柯巴基焦磷酸合成对映贝壳杉烯的多肽；(e)能够由对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸、对映贝壳杉烯酸醇和/或对映贝壳杉烯醛且与SEQIDNO：60、SEQIDNO...
【专利技术属性】
技术研发人员：亚当·马修·塔科斯，韦罗尼克·杜尚，
申请(专利权)人：埃沃尔瓦公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH
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