【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在重组宿主中产生甜菊醇糖苷专利技术背景专利
本公开涉及在重组宿主中重组产生甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和甜菊醇糖苷前体。特别地，本公开涉及在重组宿主中产生甜菊醇糖苷，所述甜菊醇糖苷包括甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷C(RebC)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷M(RebM)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜尔可苷A、单糖基化的对映-贝壳杉烯酸(ent-kaurenoicacids)、二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、三-糖基化-对映-贝壳杉烯酸、单-糖基化-贝壳杉烯醇、二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的甜菊醇糖苷、四-糖基化的甜菊醇糖苷、五-糖基化的甜菊醇糖苷、六-糖基化的甜菊醇糖苷、七-糖基化的甜菊醇糖苷或其异构体。相关技术描述众所周知，甜味剂是食物、饮料或糖果行业中最常用的成分。甜味剂既可在生产过程中掺入最终食品中，也可在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂(tabletopsweetener)或作为烘焙中糖的家用替代品独立使用。甜味剂包括天然甜味剂诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、槭糖浆和蜂蜜，和人造甜味剂诸阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖。甜叶菊提取物是可从多年生灌木甜菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜叶菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于...
【技术保护点】
1.一种能够产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：(a)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C‑19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；(b)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C‑19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；(c)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C‑19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C‑13羟基处糖基化的双功能多肽的基因，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.16 US 62/337,1901.一种能够产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：(a)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQIDNO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；(b)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQIDNO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；(c)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽的基因，所述双功能多肽与SEQIDNO：132、SEQIDNO：134、SEQIDNO：136、SEQIDNO：138、SEQIDNO：140或SEQIDNO：142、SEQIDNO：144、SEQIDNO：146或SEQIDNO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或(d)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的经标记的多肽的基因，所述多肽与SEQIDNO：174、SEQIDNO：176、SEQIDNO：178或SEQIDNO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；其中所述基因中的至少一种是重组基因；以及其中所述重组宿主细胞能够产生对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇或甜菊醇的糖苷。2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽包含对应于SEQIDNO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184TN260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q氨基酸取代。3.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽包含：(a)对应于SEQIDNO：4的K286C取代；(b)对应于SEQIDNO：4的M79V取代；(c)对应于SEQIDNO：4的S377Q取代；(d)对应于SEQIDNO：4的S80C取代；(e)对应于SEQIDNO：4的N260T和K286C取代；(f)对应于SEQIDNO：4的H184V取代；(g)对应于SEQIDNO：4的A81W和E83K取代；(h)对应于SEQIDNO：4的A81W取代；(i)对应于SEQIDNO：4的H184T取代；(k)对应于SEQIDNO：4的K286N取代；(l)对应于SEQIDNO：4的M79E取代；或(m)对应于SEQIDNO：4的K286T取代。4.如权利要求1-3中任一项所述的重组宿主细胞，其中能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽还包含标签。5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其中所述标签包含与SEQIDNO：152的二硫化物氧化还原酶、SEQIDNO：153的麦芽糖结合蛋白、SEQIDNO：154的N-利用物质或SEQIDNO：155的小遍在蛋白样修饰物具有至少90％同一性的标签序列。6.如权利要求4或5所述的重组宿主细胞，其中能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽包含与SEQIDNO：174、SEQIDNO：176、SEQIDNO：178或SEQIDNO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽。7.如权利要求1-6中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞还包含：(a)编码能够从法呢基二磷酸(FPP)和异戊烯基二磷酸(IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的多肽的基因；(b)编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸的多肽的基因；(c)编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；(d)编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸的多肽的基因；(e)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；(f)编码能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；(g)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；(h)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′进行β1，3糖基化的多肽的基因；(i)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或(k)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因；其中所述基因中的至少一种基因是重组基因。8.如权利要求7所述的重组宿主细胞，其中：(a)能够合成GGPP的所述多肽包含与SEQIDNO：20、SEQIDNO：22、SEQIDNO：24、SEQIDNO：26、SEQIDNO：28、SEQIDNO：30、SEQIDNO：32或SEQIDNO：116所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；(b)能够合成对映-柯巴基二磷酸的所述多肽包含与SEQIDNO：34、SEQIDNO：36、SEQIDNO：38、SEQIDNO：40、SEQIDNO：42或SEQIDNO：120所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；(c)能够合成对映-贝壳杉烯的所述多肽包含与SEQIDNO：44、SEQIDNO：46、SEQIDNO：48、SEQIDNO：50或SEQIDNO：52所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；(d)能够合成对映-贝壳杉烯酸的所述多肽包含与SEQIDNO：60、SEQIDNO：62、SEQIDNO：117、SEQIDNO：66、SEQIDNO：68、SEQIDNO：70、SEQIDNO：72、SEQIDNO：74或SEQIDNO：76所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；(e)能够还原细胞色素P450复合物的所述多肽包含与SEQIDNO：78、SEQIDNO：80、SEQIDNO：82、SEQIDNO：84、SEQIDNO：86、SEQIDNO：88、SEQIDNO：90、SEQIDNO：92所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；(f)能够合成甜菊醇的所述多肽包含与SEQIDNO：94、SEQIDNO：97、SEQIDNO：100、SEQIDNO：101、SEQIDNO：102、SEQIDNO：103、SEQIDNO：104、SEQIDNO：106、SEQIDNO：108、SEQIDNO：110、SEQIDNO：112或SEQIDNO：114所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；(g)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的所述多肽包含与SEQIDNO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；(h)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′进行β1，3糖基化的所述多肽包含与SEQIDNO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；(i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽包含与SEQIDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或(k)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的所述多肽包含与SEQIDNO：11所示的氨基酸序列具有80％或更高同一性的多肽；与SEQIDNO：13所示的氨基酸序列具有80％或更高同一性的多肽；或与SEQIDNO：16所示的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。9.如权利要求1-8中任一项所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组体的表达增加了由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量。10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量增加至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约100％。11.如权利要求9或10所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达增加了由所述细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷E(RebE)、甜菊醇+4Glc(#24和/或#25)，甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、莱鲍迪苷D(RebD)、甜菊醇+5Glc、莱鲍迪苷M(RebM)、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)。12.如权利要求1-11中任一项所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达减少了由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量。13.如权利要求12所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量减少至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。14.如权利要求11或12所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达减少了由所述细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量。15.如权利要求1-14中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体是以下物质或其组合物包含以下物质：13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、莱鲍迪苷F(RebF)、RebM、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜可尔苷A、单-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、单-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的甜菊醇糖苷、四-糖基化的甜菊醇糖苷、五-糖基化的甜菊醇糖苷、六-糖基化的甜菊醇糖苷，七-糖基化的甜菊醇糖苷和/或其异构体。16.如权利要求15所述的重组宿主细胞，其中：(a)所述二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA2.7；(b)所述三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA3.1或KA3.2；(c)所述二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL2.8；(d)所述三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL3.1或KOL3.2；(e)所述甜菊醇糖苷包括13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebE、RebD或RebM；(f)所述四-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物4.26或化合物4.33；(g)所述五-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物5.24或化合物5.25；(h)所述六-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物6.1或化合物6.23；和/或(i)所述七-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物7.2或化合物7.5。17.如权利要求1-16中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。18.一种在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的方法，所述方法包括在其中表达所述基因的条件下在所述细胞培养物中生长如权利要求1-17中任一项所述的重组宿主细胞，并且其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物由所述细胞培养物中的所述重组宿主细胞产生。19.如权利要求18所述的方法，其中组成型地表达所述基因和/或诱导所述基因的表达。20.如权利要求18或19所述的方法，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，由所述细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、甜菊醇+5Glc、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量增加至少约5％。21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，由所述细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量减少至少约5％。22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物中分离由此产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。23.如权利要求22所述的方法，其中所述分离步骤包括：(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的所述细胞培养物；(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；(c)提供一种或多种吸附树脂，包括在填充柱中提供所述吸附树脂；以及(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种吸附树脂接触，以获得至少一部分所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物；或者(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的所述细胞培养物；(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得含有所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；(c)提供一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱；以及(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱接触，以获得至少一部分所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物；或者(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的所述细胞培养物；(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得含有所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；(c)结晶或提取所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。24.如权利要求18-21中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物中回收所述一种或多种甜菊醇糖苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：基姆·奥尔森，约瑟夫·迈克尔·谢里登，劳拉·塔耶尔·雷科尔达，克里斯蒂安·尼芬格，韦罗尼克·杜尚，
申请(专利权)人：埃沃尔瓦公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH
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