应用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A制造技术

本发明专利技术公开了应用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A，属于甜味剂的生物合成技术领域。本发明专利技术以蔗糖为糖基供体，莱鲍迪苷A为受体，用交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A的葡萄糖基化，合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A。莱鲍迪苷A的转化率可超过90％，产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比大于37％，单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和大于50％。

【技术实现步骤摘要】
应用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A
本专利技术涉及应用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A，属于甜味剂的生物合成

技术介绍
单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A具有良好的口感和溶解性，广泛作为甜味剂和风味调节剂用于食品中。目前，葡萄糖基莱鲍迪苷A的制备多以淀粉等多糖为糖基供体，以环糊精葡萄糖基转移酶催化莱鲍迪苷A的转苷反应，得到的葡萄糖基甜菊糖苷的组成相对复杂。在环糊精葡萄糖基转移酶催化的转苷反应中，单糖和二糖不能作为糖基供体，而且莱鲍迪苷A由于分子比甜菊苷的大，空间位阻大，反应性也略差。换言之，由于多糖类糖基供体的结构复杂性，以及环糊精葡萄糖基转移酶催化转苷反应时对底物的特异性，以环糊精葡萄糖基转移酶催化合成低取代葡萄糖基莱鲍迪苷A相对较为困难。Ishikawa等利用β-味喃果糖苷酶(FFase)，在甜菊苷C-19位所连的葡萄糖基上通过β-2,6糖苷键引入一分子呋喃果糖，得到高纯度的甜菊苷-呋喃果糖产物(Ishikawa,1991)；但是FFase在反应过程中又会水解产物，使产率减小到不利于工业化生产。Kusakabe等从土壤中筛选得到一种存在于放线菌菌株K-128细胞表面的β-葡萄糖转移酶(Kusakabe,1992)，该酶只特异性地催化凝胶多糖和甜菊苷反应，得到在甜菊苷C13槐糖基上以β-1,6-糖苷键连接一分子葡萄糖的产物，虽然改性后的产品口感得到改善，但是反应时间长，反应148h后产物的产率只有20％。尽管许多酶都有转苷的能力，但只有少部分能催化甜菊糖苷的转苷反应。例如日本天野酶制品株式会社出售的来源于黑曲霉的转苷酶L-500(500TGU/g，商品名TransglucosidaseL)就不能用于甜菊苷的转苷(Wan,2012)。ThermusthermophilusDSM579所产的α-葡萄糖苷酶，对甜菊苷的转苷能力也非常低，反应24h甜菊苷的转化率小于1％(Ye,2013)。实际上，目前用于甜菊糖苷改性的糖酶，就研发人员的初衷而言，糖酶的目标底物和产物大都与甜菊糖苷改性无关----比如环糊精葡萄糖基转移酶。交替糖蔗糖酶(alternansucrase,EC2.4.1.140)，通常被用来合成交替糖寡糖，交替糖寡糖的主链是葡萄糖单元通过α-1,3-吡喃葡萄糖苷键和α-1,6-吡喃葡萄糖苷键交替连接而成。例如以蔗糖为底物合成含有α-1,3糖苷键和α-1,6糖苷键的交替糖；或以麦芽糖、异麦芽糖、龙胆二糖等寡糖为受体，蔗糖为供体，通过葡糖基转移作用生成低聚糖。且这些低聚糖具有较好的益生作用，能够有效的改善人体的肠道健康。交替糖寡糖聚合的程度可随蔗糖与受体麦芽糖的浓度和相对比率而变化，当然也随酶的性质而改变。反应产物交替糖寡糖通常由具有不同聚合度的寡糖的混合物组成。在相对高的蔗糖和麦芽糖比率时，更多的糖基单元被转移至葡聚糖中，并获得具有更高聚合度的产物。与此相反，在低的蔗糖和麦芽糖比率时，主要的反应产物是单个糖基单元转移至受体而产生的产物。例如，申请号为CN201810148068.2的专利申请中，用来源于柠檬明串珠菌的交替糖蔗糖酶，以马铃薯淀粉和蔗糖为原料，调节马铃薯淀粉和蔗糖的比例，添加高温酸性α淀粉酶、β粉淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶和交替糖蔗糖酶先后催化反应72h时，最终底物转苷效率达88.9％，合成得到二糖、三糖、四糖、五糖、六糖和七糖。但是，来源于柠檬明串珠菌的交替糖蔗糖酶催化合成葡萄糖基莱鲍迪苷A的酶活很低。
技术实现思路
本专利技术以蔗糖为糖基供体，莱鲍迪苷A为受体，用来源于枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisWB600，CGMCCNO.5757)的交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A的转苷反应，合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A；莱鲍迪苷A的转化率可超过90％，产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比大于37％，单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和大于50％。本专利技术提供了用交替糖蔗糖酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法，是将莱鲍迪苷A(RA)与蔗糖配制成反应液，加入交替糖蔗糖酶，于20-45℃恒温搅拌反应。在本专利技术一种实施方式中，反应过程中用高效液相色谱仪分析反应体系组成，待单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和大于50％或莱鲍迪苷A的转化率高于86％后，停止反应。所述反应体系包括底物、产物、催化剂、溶剂。在本专利技术一种实施方式中，当反应进行到莱鲍迪苷A的转化率不再升高时，停止反应。在本专利技术一种实施方式中，反应进行3-24h。在本专利技术的一种实施方式中，配制反应液时，所用的溶剂为水。在本专利技术的一种实施方式中，配制的反应液中RA的质量浓度为40-100g/L，RA与蔗糖质量比为1：(0.2-4)。在本专利技术的一种实施方式中，配制的反应液中RA的质量浓度为80-100g/L。在本专利技术的一种实施方式中，配制的反应液中RA与蔗糖质量比为1：(2-4)。在本专利技术的一种实施方式中，所述交替糖蔗糖酶来源于枯草杆菌(Bacillussubtilis)WB600。在本专利技术的一种实施方式中，交替糖蔗糖酶的加酶量为1-60U/gRA。在本专利技术的一种实施方式中，交替糖蔗糖酶的加酶量为10-60U/gRA。在本专利技术的一种实施方式中，反应温度为25-38℃。在本专利技术的一种实施方式中，反应过程中可以补加底物和/或酶。所述酶可以以酶液的形式或者酶粉的形式添加。所述的来源于枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisWB600)的交替糖蔗糖酶参照以下方法制备得到：将枯草芽孢杆菌接种于组成为：蛋白胨8-12g/L，酵母粉4-6g/L，氯化钠8-12g/L的培养基中，在35-38℃，180-220rpm下培养8-10h；然后以5％-10％接种量转接至组成为：酵母浸膏20-25g/L，大豆蛋白胨5-10g/L，甘油4-6g/L且初始pH6-7的培养基中，在40-41℃，180-220rpm下培养45-50h。发酵培养结束后，8000rpm离心10min，收集上清液即为交替糖蔗糖酶粗酶液。本专利技术有益效果：本专利技术直接以蔗糖为糖基供体来酶催化合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A，RA的转化率可超过90％，产品中单葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比大于37％，单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的HPLC峰面积百分比之和大于50％。附图说明图1以蔗糖为糖基供体，交替糖蔗糖酶催化RA或St转苷，各组分的HPLC面积百分比；图中，实线：×RA■RAG1●RAG2；虚线：×St■StG1●StG2；RA(或St)：蔗糖(w/w)＝1:1，10mg蔗糖/mL，40℃，20U/g蔗糖。图2不同底物质量比下,交替糖蔗糖酶催化RA转苷反应24h各组分的HPLC面积百分比；×RA，■RA-glu1，◆RA-glu2。图3补加蔗糖的情况下，交替糖蔗糖酶催化RA转苷反应，各组分的HPLC面积百分比；×RA，■RAG1，●RAG2；最终RA：蔗糖(w/w)＝1:2，32℃，20U/gRA；起始RA：蔗糖＝1:0.2，每小时补加蔗糖(mg/mL)；点线：1；短划线：2；实线：RA：蔗糖＝1:2。图4补加蔗糖和酶，交替糖蔗糖酶催化RA转苷反应，各组分的HPLC面积百分比×RA，■RA-glu1，◆RA-glu2；R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法，其特征在于，以蔗糖为糖基供体，莱鲍迪苷A为受体，以交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A的转苷反应，合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A。

【技术特征摘要】
1.一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法，其特征在于，以蔗糖为糖基供体，莱鲍迪苷A为受体，以交替糖蔗糖酶催化莱鲍迪苷A的转苷反应，合成单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A。2.根据权利要求1所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法，其特征在于，将莱鲍迪苷A与蔗糖配制成反应液，加入交替糖蔗糖酶，于20-45℃恒温搅拌反应；待反应体系中单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的百分比之和大于50％或莱鲍迪苷A的转化率高于86％后，停止反应；或者，将莱鲍迪苷A与蔗糖配制成反应液，加入交替糖蔗糖酶，于20-45℃恒温搅拌反应，当莱鲍迪苷A的转化率不再升高时停止反应。3.根据权利要求2所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法，其特征在于，配制反应液时，所用的溶剂为水。4.根据权利要求2所述的一种制备单、二葡萄糖基莱鲍迪苷A的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏咏梅，王婉洁，张童童，方云，刘湘，王海军，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32