重组宿主中的甜菊醇糖苷的产生制造技术

本发明专利技术涉及用于产生甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的重组微生物和方法。

Production of stevioside in the recombinant host

The invention relates to a recombinant microorganism and method for producing steviol glycosides and steviol glycoside precursors.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组宿主中的甜菊醇糖苷的产生专利技术背景专利
本公开大体上涉及由重组宿主诸如重组微生物重组产生甜菊醇糖苷诸如莱苞迪苷A(RebA)、莱苞迪苷B(RebB)、莱苞迪苷D(RebD)和莱苞迪苷M(RebM)以及其分离方法。具体地，本公开涉及对重组宿主中的转运系统的修饰，以增加此类甜菊醇糖苷的产生和/或此类甜菊醇糖苷到重组宿主的培养基中的分泌。相关技术描述已熟知甜味剂为食品、饮料或糖果工业中最常使用的成分。甜味剂可在生产期间并入最终食物产品中，或者当适当稀释时作为餐桌用甜味剂或烘焙时糖的家用替代物单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆以及蜂蜜)和人造甜味剂(诸如阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖)。甜叶菊提取物为可从多年生灌木甜叶菊中分离和提取的天然甜味剂。甜叶菊通常在南美和亚洲生长以用于商业生产甜叶菊提取物。纯化至各种程度的甜叶菊提取物在商业上用作食品和共混物中的高强度甜味剂或单独用作餐桌用甜味剂。若干种甜菊醇糖苷的化学结构示出在图1中，包括二萜甜菊醇和各种甜菊醇糖苷。甜叶菊植物的提取物通常包含带来甜味的甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量经常是不同的，在不同生产批次中尤其如此。由于已证实从甜叶菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷是劳动密集型且低效的，仍需要一种可产生高产量的所需甜菊醇糖苷诸如RebD和RebM的重组生产系统。还需要在重组宿主中改进的甜菊醇糖苷的产生以用于商业用途。专利技术概述针对以上背景，本专利技术提供了相对于现有技术的某些优点和改进。具体地，本专利技术提供一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含：(a)编码糖流出转运蛋白(SET)多肽的基因；和/或(b)编码糖转运蛋白SWEET(SWEET)多肽的基因；其中所述基因中的至少一种为重组基因。在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，SET多肽与SEQIDNO：18中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白A(SetA)多肽、SEQIDNO：20中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白B(SetB)多肽或SEQIDNO：22中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白C(SetC)多肽具有至少50％同一性。在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，SWEET多肽与SEQIDNO：24中所列出的芜菁(Brassicarapa)SWEET多肽、SEQIDNO：26中所列出的矮牵牛(Petuniaxhybrid)SWEET多肽或SEQIDNO：28中所列出的图小麦(Triticumurartu)SWEET多肽具有至少50％同一性。本专利技术还提供一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码运输衔接子多肽的基因的缺失。在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，在缺失之前，所缺失的基因编码与以下任一种具有至少50％同一性的运输衔接子多肽：SEQIDNO：30中所列出的衔接子蛋白Art10、SEQIDNO：32中所列出的衔接子蛋白Art1、SEQIDNO：34中所列出的衔接子蛋白Art2、SEQIDNO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQIDNO：38中所列出的衔接子蛋白Art4、SEQIDNO：40中所列出的衔接子蛋白Art6、SEQIDNO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQIDNO：44中所列出的衔接子蛋白Art8、SEQIDNO：166中所列出的衔接子蛋白衔接子蛋白Art9、SEQIDNO：46中所列出的衔接子蛋白Bu11、SEQIDNO：48中所列出的衔接子蛋白Bul2、SEQIDNO：168中所列出的衔接子蛋白Bsd2、SEQIDNO：170中所列出的衔接子蛋白Ear1、SEQIDNO：172中所列出的衔接子蛋白Ssh4或SEQIDNO：174中所列出的衔接子蛋白Tre1。在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，SEQIDNO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQIDNO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQIDNO：166中所列出的衔接子蛋白Art9、SEQIDNO：30中所列出的衔接子蛋白Art10或SEQIDNO：46中所列出的衔接子蛋白Bull的缺失增加了RebD的分泌。在本文所公开的重组宿主细胞的一个方面，SEQIDNO：32中所列出的衔接子蛋白Art1、SEQIDNO：34中所列出的衔接子蛋白Art2、SEQIDNO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQIDNO：38中所列出的衔接子蛋白Art4、SEQIDNO：40中所列出的衔接子蛋白Art6、SEQIDNO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQIDNO：44中所列出的衔接子蛋白Art8、SEQIDNO：166中所列出的衔接子蛋白Art9、SEQIDNO：30中所列出的衔接子蛋白衔接子蛋白Art10、SEQIDNO：46中所列出的衔接子蛋白Bul1、SEQIDNO：48中所列出的衔接子蛋白Bul2、SEQIDNO：174中所列出的衔接子蛋白Tre1、SEQIDNO：170中所列出的衔接子蛋白Earl或SEQIDNO：172中所列出的衔接子蛋白Ssh4的缺失增加了RebM的分泌。本专利技术还提供一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码转运蛋白多肽的基因的缺失，其中所述转运蛋白多肽为SEQIDNO：2中所列出的YOR087W、SEQIDNO：4中所列出的YML038C、SEQIDNO：6中所列出的YJR135W-A、SEQIDNO：8中所列出的YDR406W、SEQIDNO：10中所列出的YIR028W、SEQIDNO：12中所列出的YGR138C、SEQIDNO：14中所列出的YJL214W、SEQIDNO：16中所列出的YDR345C或其功能性同源物。本专利技术还提供一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码转运蛋白多肽的基因的缺失，其中所述转运蛋白多肽为SEQIDNO：64中所列出的YBR068C、SEQIDNO：66中所列出的YBR220C、SEQIDNO：68中所列出的YBR235W、SEQIDNO：70中所列出的YBR293W、SEQIDNO：72中所列出的YBR298C、SEQIDNO：74中所列出的YCR011C、SEQIDNO：76中所列出的YCR023C、SEQIDNO：78中所列出的YDL100C、SEQIDNO：80中所列出的YDL119C、SEQIDNO：82中所列出的YDL138W、SEQIDNO：84中所列出的YDL199C、SEQIDNO：86中所列出的YDL210W、SEQIDNO：88中所列出的YDL245C、SEQIDNO：90中所列出的YDR061W、SEQIDNO：92中所列出的YDR135C、SEQIDNO：94中所列出的YDR508C、SEQIDNO：96中所列出的YEL006W、SEQIDNO：98中所列出的YFL028C、SEQIDNO：100中所列出的YGL006W、SEQIDNO：102中所列出的YGL114W、SEQIDNO：104中所列出的YGR125W、SEQIDNO：106中所列出的YGR181W、SEQIDNO：108中所列出的YIL088C、SEQIDNO：110中所列出的YJR124C、SEQIDNO：112中所列出的YPL134C、S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含：(a)编码糖流出转运蛋白(SET)多肽的基因；和/或(b)编码糖转运蛋白SWEET(SWEET)多肽的基因；其中所述基因中的至少一种为重组基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.07 US 62/202,6201.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含：(a)编码糖流出转运蛋白(SET)多肽的基因；和/或(b)编码糖转运蛋白SWEET(SWEET)多肽的基因；其中所述基因中的至少一种为重组基因。2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述SET多肽与SEQIDNO：18中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白A(SetA)多肽、SEQIDNO：20中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白B(SetB)多肽或SEQIDNO：22中所列出的大肠杆菌糖流出转运蛋白C(SetC)多肽具有至少50％同一性。3.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述SWEET多肽与SEQIDNO：24中所列出的芜菁SWEET多肽、SEQIDNO：26中所列出的矮牵牛SWEET多肽或SEQIDNO：28中所列出的图小麦SWEET多肽具有至少50％同一性。4.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码运输衔接子多肽的基因的缺失。5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其中在缺失之前，所缺失的基因编码与以下任一种具有至少50％同一性的所述运输衔接子多肽：SEQIDNO：30中所列出的衔接子蛋白Artl0、SEQIDNO：32中所列出的衔接子蛋白Artl、SEQIDNO：34中所列出的衔接子蛋白Art2、SEQIDNO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQIDNO：38中所列出的衔接子蛋白Art4、SEQIDNO：40中所列出的衔接子蛋白Art6、SEQIDNO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQIDNO：44中所列出的衔接子蛋白Art8、SEQIDNO：166中所列出的衔接子蛋白衔接子蛋白Art9、SEQIDNO：46中所列出的衔接子蛋白Bul1、SEQIDNO：48中所列出的衔接子蛋白Bul2、SEQIDNO：168中所列出的衔接子蛋白Bsd2、SEQIDNO：170中所列出的衔接子蛋白Earl、SEQIDNO：172中所列出的衔接子蛋白Ssh4或SEQIDNO：174中所列出的衔接子蛋白Tre1。6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其中SEQIDNO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQIDNO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQIDNO：166中所列出的衔接子蛋白Art9、SEQIDNO：30中所列出的衔接子蛋白Art10或SEQIDNO：46中所列出的衔接子蛋白Bul1的缺失增加了RebD的分泌。7.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其中SEQIDNO：32中所列出的衔接子蛋白Art1、SEQIDNO：34中所列出的衔接子蛋白Art2、SEQIDNO：36中所列出的衔接子蛋白Art3、SEQIDNO：38中所列出的衔接子蛋白Art4、SEQIDNO：40中所列出的衔接子蛋白Art6、SEQIDNO：42中所列出的衔接子蛋白Art7、SEQIDNO：44中所列出的衔接子蛋白Art8、SEQIDNO：166中所列出的衔接子蛋白Art9、SEQIDNO：30中所列出的衔接子蛋白衔接子蛋白Art10、SEQIDNO：46中所列出的衔接子蛋白Bul1、SEQIDNO：48中所列出的衔接子蛋白Bul2、SEQIDNO：174中所列出的衔接子蛋白Tre1、SEQIDNO：170中所列出的衔接子蛋白Ear1或SEQIDNO：172中所列出的衔接子蛋白Ssh4的缺失增加了RebM的分泌。8.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码转运蛋白多肽的基因的缺失，其中所述转运蛋白多肽为SEQIDNO：2中所列出的YOR087W、SEQIDNO：4中所列出的YML038C、SEQIDNO：6中所列出的YJR135W-A、SEQIDNO：8中所列出的YDR406W、SEQIDNO：10中所列出的YIR028W、SEQIDNO：12中所列出的YGR138C、SEQIDNO：14中所列出的YJL214W、SEQIDNO：16中所列出的YDR345C或其功能性同源物。9.一种能够产生至少一种甜菊醇糖苷的重组宿主细胞，其中所述宿主包含编码转运蛋白多肽的基因的缺失，其中所述转运蛋白多肽为SEQIDNO：64中所列出的YBR068C、SEQIDNO：66中所列出的YBR220C、SEQIDNO：68中所列出的YBR235W、SEQIDNO：70中所列出的YBR293W、SEQIDNO：72中所列出的YBR298C、SEQIDNO：74中所列出的YCR011C、SEQIDNO：76中所列出的YCR023C、SEQIDNO：78中所列出的YDL100C、SEQIDNO：80中所列出的YDL119C、SEQIDNO：82中所列出的YDL138W、SEQIDNO：84中所列出的YDL199C、SEQIDNO：86中所列出的YDL210W、SEQIDNO：88中所列出的YDL245C、SEQIDNO：90中所列出的YDR061W、SEQIDNO：92中所列出的YDR135C、SEQIDNO：94中所列出的YDR508C、SEQIDNO：96中所列出的YEL006W、SEQIDNO：98中所列出的YFL028C、SEQIDNO：100中所列出的YGL006W、SEQIDNO：102中所列出的YGL114W、SEQIDNO：104中所列出的YGR125W、SEQIDNO：106中所列出的YGR181W、SEQIDNO：108中所列出的YIL088C、SEQIDNO：110中所列出的YJR124C、SEQIDNO：112中所列出的YPL134C、SEQIDNO：114中所列出的YPR192W、SEQIDNO：116中所列出的YPR194C、SEQIDNO：118中所列出的YPR198W、SEQIDNO：120中所列出的YPR201W、SEQIDNO：122中所列出的YAL067C、SEQIDNO：124中所列出的YBL089W、SEQIDNO：126中所列出的YCR028C、SEQIDNO：128中所列出的YDR438W、SEQIDNO：130中所列出的YFL011W、SEQIDNO：132中所列出的YGL084C、SEQIDNO：134中所列出的YGL104C、SEQIDNO：136中所列出的YGR224W、SEQIDNO：138中所列出的YHR032W、SEQIDNO：54中所列出的YJL093C、SEQIDNO：140中所列出的YMR034C、SEQIDNO：142中所列出的YNR055C、SEQIDNO：144中所列出的YOL020W、SEQIDNO：146中所列出的YOL075C或其功能性同源物。10.如权利要求5-9中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述基因的所述缺失通过同源重组来进行。11.如权利要求1-10中任一项所述的重组宿主细胞，其还包含以下一种或多种：(a)编码香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；(b)编码对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；(c)编码贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；(d)编码贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；(e)编码甜菊醇合酶(KAH)多肽的基因；(f)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；或者(g)编码UGT85C2多肽的基因；(h)编码UGT76G1多肽的基因；(i)编码UGT74G1多肽的基因；(j)编码UGT91D2功能性同源物的基因；和/或(k)编码EUGT11多肽的基因；其中所述基因中的至少一种为重组基因。12.如权利要求11所述的重组宿主细胞，其中：(a)所述GGPPS多肽包括与SEQIDNO：182、SEQIDNO：208、SEQIDNO：210、SEQIDNO：212、SEQIDNO：214、SEQIDNO：216、SEQIDNO：218或SEQIDNO：220中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；(b)所述CDPS多肽包括与SEQIDNO：184、SEQIDNO：222、SEQIDNO：224、SEQIDNO：226、SEQIDNO：228或SEQIDNO：230中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；(c)所述KO多肽包括与SEQIDNO：188、SEQIDNO：206、SEQIDNO：246、SEQIDNO：249、SEQIDNO：251、SEQIDNO：253、SEQIDNO：255、SEQIDNO：257、SEQIDNO：259或SEQIDNO：261中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；(d)所述KS多肽包括与SEQIDNO：186、SEQIDNO：232、SEQIDNO：234、SEQIDNO：236、SEQIDNO：238中所列出的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；(e)所述KAH多肽包括与SEQIDNO：192、SEQIDNO：266、SEQIDNO：269、SEQIDNO：270、SEQIDNO：271、SEQIDNO：272、SEQIDNO：273、SEQIDNO：275、SEQIDNO：277、SEQIDNO：279、SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦罗尼克·杜尚，米凯尔·达尔高·米克尔森，艾本·默勒汉森，
申请(专利权)人：埃沃尔瓦公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH