高-纯度甜叶菊醇糖苷制造技术

本发明专利技术描述了制备高度纯化的甜叶菊醇糖苷，特别是莱苞迪苷A，D和M的方法。所述方法包括利用将各种起始组合物转变为目标甜叶菊醇糖苷的重组微生物。此外，随制备其的方法公开了新甜叶菊醇糖苷reb D2及reb M2。高度纯化的莱苞迪苷作为非-热量甜味剂在可食用和可咀嚼的组合物诸如任何饮料，糖果，面包产品，曲奇饼干和口香糖中有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高-纯度甜叶菊醇糖苷
本专利技术涉及制备包含甜叶菊醇糖苷的组合物，包括高度纯化的甜叶菊醇糖苷组合物的生物催化过程。本专利技术也涉及新甜叶菊醇糖苷，分离其的方法和新甜叶菊醇糖苷的用途。
技术介绍
高强度甜味剂具有蔗糖的甜度水平的许多倍的甜度水平。它们基本上是非-热量的，及通常在膳食和减小的卡路里产品，包括食品和饮料中使用。高强度甜味剂不引发升胰岛素应答，使它们适合于在面向糖尿病患者和其他对于控制他们的碳水化合物摄入感兴趣的个体的产品中使用。甜叶菊醇糖苷是在甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)，在南美洲的特定地区天然生长的紫莞科(Asteraceae)(菊科(Compositae))的多年生灌木的叶中发现的一类化合物。它们结构上表征为单碱基，甜叶菊醇，由在位置C13和C19碳水化合物残基的存在而不同。它们在甜叶菊属(Stevia)叶中蓄积，组成大致10％～20％的总干重。以干重计，在甜叶菊属(Stevia)的叶中发现的4种主要糖苷一般包括甜叶菊苷(9.1％)，莱苞迪苷A(3.8％)，莱苞迪苷C(0.6～1.0％)和卫矛醇苷A(0.3％)。其他知道的甜叶菊醇糖苷包括莱苞迪苷B，C，D，E，F和M，甜叶菊双糖苷和悬钩子苷。尽管知道自甜叶菊(Steviarebaudiana)制备甜叶菊醇糖苷的方法，许多这些方法不合适于商业上使用。因此，对于简单，有效和经济的制备包含甜叶菊醇糖苷的组合物，包括高度纯化的甜叶菊醇糖苷组合物的方法仍有需求。此外，对于新甜叶菊醇糖苷和制备及分离其的方法仍有需求。【专利技术概述】本专利技术提供制备包含目标甜叶菊醇糖苷的组合物的生物催化过程，其通过使包含有机底物的起始组合物接触微生物和/或生物催化剂，由此产生包含目标甜叶菊醇糖苷的组合物。起始组合物可为任何包含至少一个碳原子的有机化合物。在一实施方式中，起始组合物选自：多元醇或糖醇，各种碳水化合物。目标甜叶菊醇糖苷可为任何甜叶菊醇糖苷。在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是甜叶菊醇单苷，甜叶菊双糖苷，悬钩子苷，卫矛醇苷B，卫矛醇苷A，莱苞迪苷B，莱苞迪苷G，甜叶菊苷，莱苞迪苷C，莱苞迪苷F，莱苞迪苷A，莱苞迪苷I，莱苞迪苷E，莱苞迪苷H，莱苞迪苷L，莱苞迪苷K，莱苞迪苷J，莱苞迪苷M，莱苞迪苷M2，莱苞迪苷D，莱苞迪苷D2，莱苞迪苷N，莱苞迪苷O或合成甜叶菊醇糖苷。在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是甜叶菊苷。在另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是莱苞迪苷A。在再一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是莱苞迪苷D。在仍另一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷是莱苞迪苷M(也被称为莱苞迪苷X)。微生物可为具有对于转变起始组合物为目标甜叶菊醇糖苷必需的酶任何微生物。生物催化剂会包含用于转变起始组合物为目标甜叶菊醇糖苷的至少一种酶。生物催化剂可位于微生物的表面上和/或在细胞内或可分泌到微生物外。生物催化剂可为全细胞悬浮液，粗裂解物或纯化的酶。生物催化剂可处于游离的形式或固定到由无机或有机材料制造的固体支持物。对于转变起始组合物为目标甜叶菊醇糖苷必需的酶包括甜叶菊醇生物合成酶，UDP-糖基转移酶(UGT)和/或UDP-再循环酶。在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶包括甲羟戊酸(MVA)通路酶。在另一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶包括非-甲羟戊酸2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸通路(MEP/DOXP)酶。在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶选自：牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，柯巴基二磷酸合酶，贝壳杉烯合酶，贝壳杉烯氧化酶，贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)，甜叶菊醇合成酶，脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)，D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)，4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)，l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)，乙酰乙酰-CoA硫解酶，截短的HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶，细胞色素P450还原酶等。UDP-葡萄糖基转移酶可为能向甜叶菊醇及或甜叶菊醇糖苷底物添加至少一个葡萄糖单元而提供目标甜叶菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶和UDP-葡萄糖基转移酶在微生物中产生。微生物可为，例如，大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp,)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，耶氏酵母属(Yarrowiasp.)等。在另一实施方式中，合成UDP-葡萄糖基转移酶。在一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶选自：UGT74G1，UGT85C2，UGT76G1，UGT91D2和与这些多肽以及编码这些UGT的分离的核酸分子具有实质性(>85％)同一性的UGT。在一实施方式中，甜叶菊醇生物合成酶，UGT和UDP-葡萄糖再循环系统存在于一个微生物中。微生物可为例如，大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp.)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，耶氏酵母属(Yarrowiasp.)在一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向悬钩子苷添加至少一个葡萄糖单元而形成甜叶菊苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。在一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向甜叶菊苷添加至少一个葡萄糖单元而形成莱苞迪苷A的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。在另一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向莱苞迪苷A添加至少一个葡萄糖单元而形成莱苞迪苷D的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。在另一实施方式中，UGT是由定向衍化产生的具有更高活性和/或选择性的UGT91D2的改善的变体。在仍另一实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是能向莱苞迪苷D添加至少一个葡萄糖单元而形成莱苞迪苷M的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。在另一实施方式中，UGT是由定向衍化产生的具有更高活性和/或选择性的UGT76G1的改善的变体。任选地，本专利技术的方法还包含再循环UDP而提供UDP-葡萄糖。在一实施方式中，方法包括通过提供再循环催化剂和再循环底物再循环UDP，使得使用催化性量的UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖(图3)实施甜叶菊醇糖苷底物生物转化为目标甜叶菊醇糖苷。在一实施方式中，再循环催化剂是蔗糖合酶。在一实施方式中，再循环底物是蔗糖。任选地，本专利技术的方法还包括自起始组合物分离目标甜叶菊醇糖苷。目标甜叶菊醇糖苷可由至少一种适合的方法，诸如，例如，结晶，由膜分离，离心，提取，层析分离或此类方法的组合分离。在一实施方式中，目标甜叶菊醇糖苷可在微生物内产生。在另一实施方式中，目标甜叶菊本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷的方法，包括下列步骤：(a)提供起始组合物，其包含具有至少一个碳原子的有机化合物；(b)提供微生物，其含有选自下列的至少一种酶：甜叶菊醇生物合成酶，UDP‑糖基转移酶和任选地UDP‑葡萄糖再循环酶；(c)使微生物接触含有起始组合物的培养基而产生包含至少一种目标甜叶菊醇糖苷的培养基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.28 US 61/827,922;2013.07.08 US 61/843,544;1.产生高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷的方法，其中所述目标甜叶菊醇糖苷选自：rebM，rebM2，rebD2和其混合物，其中所述rebM2的化学式是13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯]，且所述rebD2的化学式是13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯]；且其中所述方法包括下列步骤：(a)提供起始组合物，其包含甜叶菊醇糖苷；(b)提供微生物，其含有UDP-糖基转移酶；以及(c)使微生物接触含有起始组合物的培养基而产生包含至少一种目标甜叶菊醇糖苷的培养基。2.产生高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷的方法，其中所述目标甜叶菊醇糖苷选自：rebM，rebM2，rebD2和其混合物，其中所述rebM2的化学式是13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯]，且所述rebD2的化学式是13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-酸-[(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)酯]；且其中所述方法包括下列步骤：(a)提供起始组合物，其包含甜叶菊醇糖苷；(b)提供生物催化剂，其包含UDP-糖基转移酶；以及(c)使生物催化剂接触含有起始组合物的培养基而产生包含至少一种目标甜叶菊醇糖苷的培养基。3.权利要求1或2的方法，其还包括下列步骤：(d)自培养基分离目标甜叶菊醇糖苷而提供高度纯化的目标甜叶菊醇糖苷组合物。4.权利要求1的方法，其中所述微生物选自：大肠埃希氏菌(E.coli)，糖酵母属(Saccharomycessp.)，曲霉属(Aspergillussp.)，毕赤酵母属(Pichiasp.)，芽孢杆菌属(Bacillussp.)和耶氏酵母属(Yarrowiasp.)。5.权利要求2的方法，其中所述生物催化剂选自：全细胞悬浮液，粗...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·马寇思言，I·普拉卡什，C·邦德斯，P·索尼，J·赛里勒，A·巴蒂，R·泰阿莱，
申请(专利权)人：谱赛科有限责任公司，可口可乐公司，
类型：发明
国别省市：马来西亚;MY