高纯度的甜菊醇糖苷制造技术

本申请涉及高纯度的甜菊醇糖苷。本申请描述了制备高度纯化的甜菊醇糖苷、特别是莱鲍迪苷A、D和M的方法。这些方法包括利用将不同的起始组合物转化为靶甜菊醇糖苷的重组微生物。另外，披露了新颖的甜菊醇糖苷reb D2和reb M2，也披露了制备它们的方法。高度纯化的莱鲍迪苷在可食用和可咀嚼组合物例如任何饮料、糕饼、焙烤产品、饼干和口香糖中可用作无热量甜味剂。

【技术实现步骤摘要】
高纯度的甜菊醇糖苷本申请是申请日为2014年5月28日，申请号为201480040130.6，专利技术名称为“高纯度的甜菊醇糖苷”的申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2013年5月28日提交的美国临时专利申请号61/827,922；2013年7月8日提交的美国临时专利申请号61/843,544；2013年8月2日提交的美国临时专利申请号61/861,528；2013年9月23日提交的美国临时专利申请号61/881,166；2013年10月1日提交的美国临时专利申请号61/885,084；2013年11月15日提交的美国临时专利申请号61/904,751；2013年12月9日提交的美国临时专利申请号61/913,482；2013年12月30日提交的美国临时专利申请号61/921,635；2014年1月9日提交的美国临时专利申请号61/925,329、以及2014年2月14日提交的美国临时专利申请号61/939,855的优先权。以上引用的优先权文件以其整体充分地结合在此。
本专利技术涉及用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法，所述组合物包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物。本专利技术还涉及新颖的甜菊醇糖苷、用于分离所述甜菊醇糖苷的方法以及这些新颖的甜菊醇糖苷的用途。专利技术背景高强度甜味剂具有比蔗糖甜味水平高许多倍的甜味水平。它们基本上无热量，并且普遍用于饮食和低热量产品中，包括食品和饮料。高强度甜味剂不引发升糖反应，从而使得它们适合用于针对糖尿病患者和有兴趣控制其碳水化合物摄入的其他人群的产品中。甜菊醇糖苷是一类在甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)(原产于南美某些地区的菊科(Asteraceae(Compositae))的多年生灌木)叶中发现的化合物。它们的结构特征在于单个碱，甜菊醇，差异在于位置C13和C19上碳水化合物残基的存在。它们在甜叶菊的叶子中积累，构成大约10％-20％的总干重。基于干重，在甜菊属叶中发现的4种主要糖苷通常包括甜菊苷(stevioside)(9.1％)、莱鲍迪苷A(3.8％)、莱鲍迪苷C(0.6％-1.0％)和杜尔可苷A(dulcosideA)(0.3％)。其他已知的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷B、C、D、E、F和M，甜菊双苷和甜叶悬钩子苷。虽然已知用于从甜叶菊制备甜菊醇糖苷的方法，但这些方法大多不适合于商业使用。因此，仍然存在对用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物)的简单、高效且经济的方法的需要。另外，仍然存在对新颖的甜菊醇糖苷及其制备和分离方法的需要。专利技术概述本专利技术提供了用于制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法，该生物催化法包括使含有起始组合物的介质与生物催化剂接触，该起始组合物包括含有至少一个碳原子的有机化合物，由此产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物。在另一个实施例中，本专利技术提供了用于产生靶甜菊醇糖苷的方法，该方法包括使一种有机化合物和选自甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶的至少一种酶接触，由此产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物。该包含至少一个碳原子的有机化合物是用于生物转化的底物。在一个实施例中，该有机化合物选自下组，该组由以下各项组成：多元醇或糖醇、或各种碳水化合物。在另一个实施例中，该有机化合物为至少一种甜菊醇糖苷。靶甜菊醇糖苷可以是与底物甜菊醇糖苷不相同的任何甜菊醇糖苷。在一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O或合成的甜菊醇糖苷。在一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是甜菊苷。在另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷A。在再另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷D。在又另一个实施例中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷M(也称为莱鲍迪苷X)。在优选的实施例中，生物催化剂是一种酶、或包含一种或多种酶的细胞，所述酶能够将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷。生物催化剂可以位于细胞的表面上和/或内部。生物催化剂可以被提供为全细胞悬液、粗裂解物或一种或多种纯化酶的形式。生物催化剂可以处于游离形式或被固定至由无机或有机材料制造的固体支持物。在一些实施例中，微生物包含用于将有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的一种或多种必需生物催化剂。因此，本专利技术还提供了用于通过以下方式制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法：使包含有机化合物的起始组合物与包含能够将该有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷的至少一种酶的微生物接触，由此产生包含至少一种靶甜菊醇糖苷的介质。用于将该有机化合物转化为靶甜菊醇糖苷必需的酶包括甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶(UGT)和/或UDP-循环酶。在一个实施例中，甜菊醇生物合成酶选自下组，该组由以下各项组成：香叶基香叶基二磷酸合酶、柯巴基二磷酸合酶、贝壳杉烯合酶、贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)、甜菊醇合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)、l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、l-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)、乙酰乙酰-CoA硫解酶、截短的HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和细胞色素P450还原酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊醇和/或甜菊醇糖苷底物以提供靶甜菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在一个实施例中，甜菊醇生物合成酶和UDP-葡萄糖基转移酶是在微生物中产生的。微生物可以是例如，大肠杆菌、酵母菌属物种、曲霉菌属物种、毕赤酵母属物种、芽孢杆菌属物种、耶氏酵母属物种等。在另一个实施例中，合成了UDP-葡萄糖基转移酶。在一个实施例中，UDP-葡萄糖基转移酶选自下组，该组由以下各项组成：UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1、UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GI号460410132版本XP_004250485.1)、UGTLB、GI号460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GI号115454819版本NP_001051010.1、GI号187373030、版本ACD03249.1、GI号222619587版本EEE55719.1、GI号297795735版本XP_002865752.1或EUGT11以及与这些多肽具有实质性(>85％)一致性的UGT、连同具有编码这些UGT的分离的核酸分子的UGT。在一个实施例中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生靶甜菊醇糖苷的方法，该方法包括以下步骤：/na.提供包含具有至少一个碳原子的有机化合物的起始组合物；/nb.提供含有选自甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶的至少一种酶的并且任选地提供UDP-葡萄糖循环酶的微生物；/nc.使该微生物与含有该起始组合物的介质接触以产生包含至少一种靶甜菊醇糖苷的介质。/n

【技术特征摘要】
20130528 US 61/827,922;20130708 US 61/843,544;20131.一种用于产生靶甜菊醇糖苷的方法，该方法包括以下步骤：
a.提供包含具有至少一个碳原子的有机化合物的起始组合物；
b.提供含有选自甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶的至少一种酶的并且任选地提供UDP-葡萄糖循环酶的微生物；
c.使该微生物与含有该起始组合物的介质接触以产生包含至少一种靶甜菊醇糖苷的介质。


2.一种用于产生靶甜菊醇糖苷的方法，该方法包括以下步骤：
a.提供包含具有至少一个碳原子的有机化合物的起始组合物；
b.提供包含选自甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶、和任选地UDP-葡萄糖循环酶的至少一种酶的生物催化剂；
c.使该生物催化剂与含有该起始组合物的介质接触以产生包含至少一种靶甜菊醇糖苷的介质。


3.如权利要求1或2所述的方法，该方法进一步包括以下步骤：
d.从该介质纯化该靶甜菊醇糖苷以提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。


4.如权利要求1或2所述的方法，其中该有机化合物选自下组，该组由以下各项组成：多元醇、碳水化合物、甜菊醇糖苷及其组合。


5.如权利要求1或2所述的方法，其中该是葡萄糖并且该方法是发酵法。


6.如权利要求1或2所述的方法，其中该起始组合物包含甜菊醇糖苷。


7.如权利要求1所述的方法，其中该微生物选自下组，该组由以下各项组成：大肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：因德拉·普拉卡什，辛西娅·邦德斯，潘卡杰·索尼，阿韦季克·马科西安，加林·西里尔，奥雷利安·巴迪，罗贝尔·泰·阿莱，
申请(专利权)人：谱赛科有限责任公司，
类型：发明
国别省市：马来西亚;MY