甜菊糖苷莱苞迪苷J和莱苞迪苷N的生物合成生产制造技术

本公开涉及通过使用莱苞迪苷A作为底物和涉及各种1,2RhaT‑鼠李糖基转移酶的生物合成途径来产生甜菊糖苷莱苞迪苷J和莱苞迪苷N。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甜菊糖苷莱苞迪苷J和莱苞迪苷N的生物合成生产相关申请的交叉引用本申请要求2018年3月12日提交的美国临时专利申请号62/641,590和2018年6月8日提交的美国临时专利申请号62/682,260的优先权，这两个临时专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
本公开一般涉及甜菊糖苷的生物合成。更具体地，本公开涉及用于制备包含莱苞迪苷J(“RebJ”)和/或莱苞迪苷N(“RebN”)的组合物的生物催化方法，以及具有在用于产生RebJ和/或RebN的相关生物合成途径中有用的酶活性的重组多肽。
技术介绍
甜菊糖苷是在甜叶菊(Steviarebaudiana)植物的叶中发现的一类化合物，其可用作高强度、低热量的甜味剂。这些天然存在的甜菊糖苷共有相同的基本二萜结构(甜菊醇主链)，但在甜菊醇主链的C13和C19位置的糖残基(例如葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的数量和类型方面不同。有趣的是，基本甜菊醇结构的糖“装饰”中的这些变化通常显著且不可预测性地影响所得甜菊糖苷的特性。受影响的特性可包括但不限于总体口感特征、任何异味的存在和程度、结晶点、“口感”、溶解度和感觉到的甜度以及其他差异。具有已知结构的甜菊糖苷包括甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、莱苞迪苷M、莱苞迪苷J、莱苞迪苷N和杜尔可苷A。基于干重计，甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷C和杜尔可苷A分别占野生型甜叶菊叶中发现的所有甜菊糖苷的总重量的约9.1％、3.8％、0.6％和0.3％。其他甜菊糖苷诸如RebJ和RebN以显著更低的含量存在。来自甜叶菊植物的提取物是可商购获得的。在此类提取物中，甜菊苷和莱苞迪苷A通常是主要组分，而其他已知的甜菊糖苷则作为微量或痕量组分存在。在任何给定的甜叶菊提取物中的各种甜菊糖苷的实际含量水平可根据例如甜叶菊植物生长的气候和土壤、收获甜叶菊叶的条件和用于提取期望的甜菊糖苷的方法而变化。出于说明，商业制备物中莱苞迪苷A的量可在总甜菊糖苷含量的约20重量％至大于约90重量％之间变化，而莱苞迪苷B、莱苞迪苷C和莱苞迪苷D的量可分别为总甜菊糖苷含量的约1重量％至2重量％、约7重量％至15重量％和约2重量％。在此类提取物中，莱苞迪苷J和莱苞迪苷N各自通常占总甜菊糖苷含量的小于0.5重量％。作为天然甜味剂，不同的甜菊糖苷具有不同程度的甜味、口感和余味。甜菊糖苷的甜度显著高于食用糖(即蔗糖)的甜度。例如，甜菊苷本身的甜度是蔗糖的100-150倍，但具有苦的回味，如在许多味道测试中所注意到的，而莱苞迪苷A和E的甜度是蔗糖的250-450倍，并且回味特征比甜菊苷好得多。然而，这些甜菊糖苷本身仍保持明显的余味。因此，任何甜叶菊提取物的总体味道特征均受提取物中各种甜菊糖苷的相对含量的深刻影响，而所述相对含量又可受植物来源、环境因素(诸如土壤含量和气候)和提取方法的影响。特别地，提取条件的变化可导致甜叶菊提取物中甜菊糖苷的组成不一致，使得味道特征在不同批次的提取产品中变化。甜叶菊提取物的味道特征也可能受提取过程后保留在产品中的植物来源或环境来源的污染物(诸如色素、脂质、蛋白质、酚类和糖类)的影响。这些污染物通常具有对于将甜叶菊提取物用作甜味剂来说不期望的异味。此外，分离在甜叶菊提取物中不丰富的单独或特定组合的甜菊糖苷的方法可能会在成本和资源上令人望而却步。此外，从植物中提取的方法通常采用使用溶剂诸如己烷、氯仿和乙醇的固-液提取技术。溶剂萃取为能量密集型方法，并且可能导致与有毒废物处理有关的问题。因此，需要新的生产方法来降低甜菊糖苷的生产成本以及减轻大规模培养和加工的环境影响。因此，在本领域中需要一种新的制备甜菊糖苷特别是微量甜菊糖苷诸如RebJ和RebN的方法，其可产生具有更好和更一致的味道特征的产品。更优选地，此类制备方法可利用更丰富的甜菊糖苷诸如RebA以降低生产成本。
技术实现思路
在一些实施方案中，本公开涵盖从RebA制备RebJ的方法以及通过RebJ的中间体从RebA制备RebN的方法。在一些实施方案中，本公开提供了从RebI制备RebN的方法，以及通过RebI的中间体从RebA制备RebN的方法。在一个实施方案中，本公开提供了通过本文所述的各种1,2-鼠李糖基转移酶从RebA产生甜菊糖苷莱苞迪苷J“RebJ”或13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-羧酸-[(2-O-α-L-吡喃鼠李糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯]。图1示出了RebJ的化学结构。在另一个实施方案中，本公开提供了通过本文所述的各种UDP-糖基转移酶从RebJ产生甜菊糖苷莱苞迪苷N“RebN”或13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧基]对映-贝壳杉-16-烯-19-羧酸-[(2-O-α-L-吡喃鼠李糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯]。图2示出了RebN的化学结构。本方法提供了使用某些特定的合成途径合成特定的甜菊糖苷的方法。在产品/商业实用性方面，在美国市场上存在数十种含有甜菊糖苷的产品，并且可用于从食品、饮料和饮食补充剂到止痛药和驱虫剂的任何事物中。含有甜菊糖苷的产品可以是液体、颗粒制剂、凝胶或气溶胶。本文尤其提供了制备莱苞迪苷诸如莱苞迪苷N的生物合成方法，该方法包括在具有1,2-鼠李糖基转移酶活性的第一重组多肽存在下使甜菊糖苷组合物与鼠李糖供体部分反应；其中该第一重组多肽包含与SEQIDNO:3、SEQIDNO:9或SEQIDNO:19具有至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该第一重组多肽包含与SEQIDNO:3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该第一重组多肽包含与SEQIDNO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该第一重组多肽包含与SEQIDNO:19具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的生物合成方法包括在转化的细胞系统中表达该第一重组多肽。在一些实施方案中，转化的细胞系统选自由以下组成的组：酵母、不产生甜菊糖苷的植物、藻类、真菌和细菌。在一些实施方案中，细菌或酵母选自由以下组成的组：埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、甲基弯菌属(M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备莱苞迪苷N的生物合成方法，所述方法包括：/n在具有1,2-鼠李糖基转移酶活性的第一重组多肽的存在下使甜菊糖苷组合物与鼠李糖供体部分反应；其中所述第一重组多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:19具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180312 US 62/641590;20180608 US 62/682260;2018071.一种制备莱苞迪苷N的生物合成方法，所述方法包括：
在具有1,2-鼠李糖基转移酶活性的第一重组多肽的存在下使甜菊糖苷组合物与鼠李糖供体部分反应；其中所述第一重组多肽包含与SEQIDNO:3、SEQIDNO:9或SEQIDNO:19具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一重组多肽包含与SEQIDNO:3具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一重组多肽包含与SEQIDNO:9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一重组多肽包含与SEQIDNO:19具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法包括在转化的细胞系统中表达所述第一重组多肽。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转化的细胞系统选自由以下组成的组：酵母、不产生甜菊糖苷的植物、藻类、真菌和细菌。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述转化的细胞系统为选自由以下组成的组的细菌或酵母：埃希氏菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、链霉菌属、棒状杆菌属、甲基弯菌属、甲基单胞菌属、红球菌属、假单胞菌属、红细菌属、集胞藻属、酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉菌属、毕赤酵母属、球拟酵母属、曲霉属、关节杆菌属、短杆菌属、微杆菌属、节杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和梭菌属。


8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述反应步骤在所述转化的细胞系统中进行。


9.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，所述方法包括从所述转化的细胞系统中分离所述第一重组多肽，并且所述反应步骤在体外进行。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述鼠李糖供体部分为UDP-L-鼠李糖。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述甜菊糖苷组合物包含莱苞迪苷A，并且所述反应步骤导致莱苞迪苷J的产生。


12.根据权利要求11所述的方法，所述方法包括在具有葡糖基转移酶活性的第二重组多肽存在下使所述莱苞迪苷J与葡萄糖供体部分反应。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述葡萄糖供体部分为原位生成的。


14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述第二重组多肽具有葡糖基转移酶活性和蔗糖合酶活性两者。


15.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述第二重组多肽包含与SEQIDNO:7、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13或SEQIDNO:15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。


16.根据权利要求12或13所述的方法，所述方法包括在具有蔗糖合酶活性的第三重组多肽存在下使所述莱苞迪苷J与葡萄糖供体部分反应。


17.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述甜菊糖苷组合物包含莱苞迪苷I。


18.根据权利要求17所述的方法，其中所述莱苞迪苷I通过在具有葡糖基转移酶活性的第二重组多肽存在下使包含莱苞迪苷A的甜菊糖苷组合物与葡萄糖供体部分反应来制备。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述葡萄糖供体部分为...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛国红，M·巴腾，P·宏特，余晓丹，
申请(专利权)人：科纳根公司，
类型：发明
国别省市：美国;US