UDP-鼠李糖的生物合成生产制造技术

本公开内容涉及UDP

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】UDP
‑
鼠李糖的生物合成生产
[0001]对相关申请的交叉引用本申请要求2019年3月29日提交的美国临时申请系列号62/825,799的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
专利

[0002]本公开内容总体上涉及二磷酸尿苷鼠李糖(“UDP
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鼠李糖”或“UDPR”或“UDP
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Rh”)的生物合成。更具体地，本公开内容涉及：用于制备UDP
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鼠李糖的生物催化方法，其进而可用于含鼠李糖的甜菊糖苷的生物合成；以及具有可用于产生UDP
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鼠李糖和含鼠李糖的甜菊糖苷的有关生物合成途径的酶活性的重组多肽。

技术介绍

[0003]甜菊糖苷是在甜叶菊(Stevia rebaudiana)植物的叶子中发现的一类化合物，其可以用作高强度、低热量的甜味剂。这些天然存在的甜菊糖苷具有相同的基本二萜结构(甜菊醇主链)，但在甜菊醇主链的C13和C19位置处的碳水化合物残基(例如，葡萄糖、鼠李糖和木糖残基)的数量和类型是不同的。有趣的是，基本甜菊醇结构的糖“装饰”中的这些变化经常显著地且不可预测地影响得到的甜菊糖苷的性能。受影响的性能可以包括但不限于总体味道特征、任何异味的存在和程度、结晶点、“口感”、溶解度和感觉到的甜度以及其它差异。具有已知结构的甜菊糖苷包括蛇菊苷、莱鲍迪苷A (“Reb A”)、莱鲍迪苷B (“Reb B”)、莱鲍迪苷C (“Reb C”)、莱鲍迪苷D (“Reb D”)、莱鲍迪苷E (“Reb E”)、莱鲍迪苷F (“Reb F”)、莱鲍迪苷M (“Reb M”)、莱鲍迪苷J (“Reb J”)、莱鲍迪苷N (“Reb N”)和杜尔可苷A。
[0004]基于干重，蛇菊苷、Reb A、Reb C和杜尔可苷A分别占野生型甜叶菊叶中发现的所有甜菊糖苷的总重量的大约9.l%、3.8%、0.6%和0.3%。其它甜菊糖苷诸如Reb J和Reb N以显著更低的量存在。来自甜叶菊植物的提取物是商购可得的。在此类提取物中，蛇菊苷和Reb A通常是主要组分，而其它已知的甜菊糖苷则作为微量或痕量组分存在。在任何给定的甜叶菊提取物中的各种甜菊糖苷的实际含量水平可以根据例如甜叶菊植物生长的气候和土壤、收获甜叶菊叶的条件和用于提取期望的甜菊糖苷的方法而变化。为了说明，商业制备物中Reb A的量可以在总甜菊糖苷含量的约20重量%至超过约90重量%之间变化，而Reb B、Reb C和Reb D的量可以分别为总甜菊糖苷含量的约1
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2重量%、约7
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15重量%和约2重量%。在此类提取物中，Reb J和Reb N各自通常占总甜菊糖苷含量的小于0.5重量%。
[0005]作为天然甜味剂，不同的甜菊糖苷具有不同程度的甜度、口感和余味。甜菊糖苷的甜度显著高于食用糖(即蔗糖)的甜度。例如，蛇菊苷本身的甜度是蔗糖的100
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150倍，但具有苦的余味，如在许多味道试验中所注意到的，而Reb A和Reb E的甜度是蔗糖的250
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450倍，并且余味特征比蛇菊苷好得多。但是，这些甜菊糖苷本身仍保持明显的余味。因此，任何甜叶菊提取物的总体味道特征均受提取物中各种甜菊糖苷的相对含量的深刻影响，而所述相对含量进而可能受植物来源、环境因素(诸如土壤含量和气候)和提取方法的影响。特别地，提取条件的变化可以导致甜叶菊提取物中甜菊糖苷的不一致组成，使得味道特征在不
同批次的提取产品之间变化。甜叶菊提取物的味道特征也可以受提取过程后保留在产品中的植物衍生的或环境衍生的污染物(诸如色素、脂质、蛋白、酚类和糖类)的影响。这些污染物通常具有对于将甜叶菊提取物用作甜味剂来说不期望的异味。此外，分离在甜叶菊提取物中不丰富的单独或特定组合的甜菊糖苷的方法可能会在成本和资源上令人望而却步。
[0006]此外，从植物中提取的方法通常采用使用溶剂诸如己烷、氯仿和乙醇的固
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液提取技术。溶剂提取是一种能量密集型方法，并且可以导致与有毒废物处理有关的问题。因此，需要新的生产方法来降低甜菊糖苷生产的成本以及减轻大规模培养和加工的环境影响。
[0007]因此，本领域需要新的制备甜菊糖苷、特别是含鼠李糖的甜菊糖苷诸如Reb J和Reb N的方法，其可以产生具有更好和更一致的味道特征的产品。鉴于通向此类含鼠李糖的甜菊糖苷的生物合成途径经常使用UDP
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鼠李糖作为起始底物之一，本领域需要UDP
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鼠李糖的新颖且有效的制备方法。

技术实现思路

[0008]在不同的实施方案中，本公开内容涵盖制备UDP
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鼠李糖的生物合成方法。在一个优选的实施方案中，本公开内容涉及一种制备二磷酸尿苷β
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L
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鼠李糖(“UDP
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L
‑
鼠李糖”或“UDP
‑
L
‑
R”或UDP
‑
L
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Rh”)的生物合成方法。通常，所述方法包括在有NAD
+
和NADPH的来源存在下将二磷酸尿苷
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葡萄糖(“UDP
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葡萄糖”或“UDPG”)与一种或多种重组多肽一起温育足够的时间以产生UDP
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鼠李糖，其中所述一种或多种重组多肽单独地或共同地具有UDP
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鼠李糖合酶活性。
[0009]在某些实施方案中，一种或多种重组多肽可以是具有UDP
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葡萄糖4,6
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脱水酶、UDP
‑4‑
酮
‑6‑
脱氧
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葡萄糖3,5
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表异构酶和UDP
‑4‑
酮
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鼠李糖4
‑
酮
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还原酶活性的三功能酶。这样的三功能多肽也被称作RHM酶。在这样的实施方案中，一种或多种重组多肽可以选自来自蓖麻(Ricinus communis)、水蕨(Ceratopteris thalictroides)、细叶满江红(Azolla filiculoides)、绿色鞭毛藻(Ostreococcus lucimarinus)、微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)、石莼(Ulva lactuca)、Golenkinia longispicula、亚心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)或心形四爿藻(Tetraselmis cordiformis)的RHM酶。在这些实施方案中，一种或多种重组多肽可以选自包含与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 89具有至少80%、至少85%、至少90%本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】NO: 62具有至少80%序列同一性的核苷酸序列。17. 根据权利要求13
‑
15中的任一项所述的方法，其中所述第二核苷酸包含与SEQ ID NO: 64具有至少80%序列同一性的核苷酸序列。18. 根据权利要求2所述的方法，其中所述三功能酶包含与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。19. 根据权利要求4所述的方法，其中所述第一重组多肽包含与SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 37具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。20. 根据权利要求4或19所述的方法，其中所述第二重组多肽包含与SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 71具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。21.根据权利要求1
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20中的任一项所述的方法，所述方法包括在转化的细胞系统中表达所述一种或多种重组多肽。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述转化的细胞系统选自酵母、不产生UDP
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鼠李糖的植物、藻类、真菌和细菌。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述转化的细胞系统是选自以下的细菌或酵母：埃希氏菌属；沙门氏菌属；芽孢杆菌属；不动杆菌属；链霉菌属；棒杆菌属；甲基弯曲菌属；甲基单胞菌属；红球菌属；假单胞菌属；红细菌属；集胞蓝细菌属；酵母属；接合酵母属；克鲁维酵母属；假丝酵母属；汉逊酵母属；德巴利酵母属；毛霉菌属；毕赤酵母属；球拟酵母属；曲霉菌属; Arthrobotlys；短杆菌属；微杆菌属；节杆菌属；柠檬酸杆菌属；克雷伯氏菌属；泛菌属；和梭菌属。24.根据权利要求1
‑
23中的任一项所述的方法，其中通过UDP
‑4‑
酮
‑6‑
脱氧
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葡萄糖作为中间体从UDP
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葡萄糖产生UDP
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鼠李糖。25.根据权利要求24所述的方法，其中在已经将UDP
‑
葡萄糖与一种或多种重组多肽一起温育足够的时间以产生UDP
‑4‑
酮
‑6‑
脱氧
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葡萄糖以后，提供NADPH的来源。26.根据权利要求25所述的方法，其中NADPH的来源包含氧化反应底物和NADP
+
依赖性酶。27.根据权利要求25所述的方法，其中NADPH的来源包含苹果酸和苹果酸酶。28.根据权利要求25所述的方法，其中NADPH的来源包含甲酸和甲酸脱氢酶。29.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛国红，P，
申请(专利权)人：科纳根公司，
类型：发明
国别省市：