莱苞迪甙A的制备方法、莱苞迪甙A制备用酶及应用技术

本发明专利技术提供了一种莱苞迪甙A的制备方法，包括：在二磷酸尿苷葡萄糖和葡萄糖基转移酶存在下，以甜菊糖原料为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为6.0‑8.0，在恒定温度20‑45℃下进行搅拌反应后，收集得到莱苞迪甙A；所述甜菊糖原料包括甜菊苷，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该制备方法是一个高效简便，成本低，转化率高，绿色环保的生物酶法，可以广泛适用于工业化规模生产。本发明专利技术还提供了莱苞迪甙A制备用酶及应用。

The preparation methods, enzymes and applications of rhabditoside A

The invention provides a preparation method of rhizoidin A, which includes: in the presence of uridine diphosphate glucose and glucosyltransferase, a reaction liquid is prepared with stevioside raw material as a substrate, the pH of the reaction liquid is adjusted to 6.0 8.0, and after stirring reaction at a constant temperature of 20 45 (?) C, rhizoidin A is collected; the stevioside raw material includes stevioside, the glucose. The amino acid sequence of the transferase includes the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:1. The preparation method is a high efficiency, simple, low cost, high conversion rate, green and environmental protection biological enzymatic method, which can be widely applied to industrial scale production. The present invention also provides enzymes for the preparation of rhabditoside A and their application.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】莱苞迪甙A的制备方法、莱苞迪甙A制备用酶及应用
本专利技术涉及生物医药
，特别涉及莱苞迪甙A的制备方法、莱苞迪甙A制备用酶及应用。
技术介绍
甜菊糖(Steviolglycoside)，又名甜菊糖苷，是一种低热量高倍甜味剂，其甜度为蔗糖的150-300倍，热量约为蔗糖的1/300。研究表明，具有无毒副作用，食用安全，并且研究表明甜菊糖可用于预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病和龋齿等病症，是一种可替代蔗糖非常理想的甜味剂。然而，甜菊糖各组分的甜度倍数和口感参差不齐；例如主要组分之一的甜菊苷(Stevioside，St)具有后苦味和余味，极大地局限了其应用；而莱苞迪甙A(RebaudiosideA，RA)在甜度、热量和理化性质上均优于甜菊苷，而且口感最接近蔗糖。现有技术中，莱苞迪甙A生产方法大多集中在培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A，或使用环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性。然而上述工艺步骤繁琐，能耗高，污染大，纯度与产率均偏低。因此，有必要发展一种工艺简单、成本低、产率高且绿色环保的莱苞迪甙A的制备方法。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了莱苞迪甙A的制备方法、莱苞迪甙A制备用酶及应用；该制备方法工艺简单、产量高、成本低和绿色安全。第一方面，本专利技术提供了莱苞迪甙A的制备方法，包括：在二磷酸尿苷葡萄糖(Uridinediphosphateglucose，UDPG)和葡萄糖基转移酶存在下，以甜菊糖原料为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为6.0-8.0，在恒定温度20-45℃下进行搅拌反应后，收集得到莱苞迪甙A；所述甜菊糖原料包括甜菊苷，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。本专利技术所述葡萄糖基转移酶来源于栀子花(Gardeniajasminoides)。所述二磷酸尿苷葡萄糖(UDPG)也可称为尿苷-5'-二磷酸葡萄糖或尿苷二磷酸葡萄糖。本专利技术中，所述甜菊苷(St)，或称甜菊甙，分子式为C38H60O18，化学结构如式Ⅰ所示。所述莱苞迪甙A(RA)，或称甜菊A苷、A苷甜菊糖，分子式为C44H70O23，化学结构如式Ⅱ所示：本专利技术中，所述莱苞迪甙A的制备方法的工艺路线如式(1)所示：其中，所述甜菊糖原料包括甜菊苷(St)，所述甜菊苷和所述二磷酸尿苷葡萄糖经葡萄糖基转移酶的催化作用下得到莱苞迪甙A(RA)，而所述二磷酸尿苷葡萄糖在反应中生成尿苷二磷酸(Uridinetriphosphate，UDP)。所述尿苷二磷酸也可称为尿苷-5'-二磷酸。可选地，所述反应液中的所述二磷酸尿苷葡萄糖通过在所述反应液中直接加入或通过在所述反应液中加入混合原料获得，所述混合原料包括尿苷二磷酸(UDP)和所述二磷酸尿苷葡萄糖中的一种或两种、蔗糖(Sucrose)和蔗糖合成酶(SucroseSynthase，SuS)。例如，所述混合原料包括尿苷二磷酸、二磷酸尿苷葡萄糖、蔗糖和蔗糖合成酶，或所述混合原料包括二磷酸尿苷葡萄糖、蔗糖和蔗糖合成酶，或所述混合原料包括尿苷二磷酸、蔗糖和蔗糖合成酶。所述所述蔗糖合成酶(SuS)，又称蔗糖合酶，是植物中广泛存在的一种糖基转移酶。可选地，所述莱苞迪甙A的制备方法的工艺路线还可以如式(2)所示：其中，所述尿苷二磷酸、所述蔗糖和所述蔗糖合成酶可以在所述反应液中反应得到所述二磷酸尿苷葡萄糖并形成所述二磷酸尿苷葡萄糖的循环再生体系；所述甜菊苷在所述葡萄糖基转移酶的催化作用下制备得到莱苞迪甙A，所述葡萄糖基转移酶能够在所述甜菊糖苷的13位的碳原子的糖基上再引入一葡糖糖基；所述蔗糖在所述蔗糖合成酶的催化下生成果糖。可选地，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列包括如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。可选的，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列的基因编码序列应该考虑简并碱基，即如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQIDNO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQIDNO:1。可选地，当所述混合原料包括尿苷二磷酸、蔗糖和蔗糖合成酶时，所述尿苷二磷酸、所述蔗糖和所述蔗糖合成酶的质量比为(0.0001-0.04)：(0.1-2)：(0.1-1)。进一步地，可选地，所述尿苷二磷酸、所述蔗糖和所述蔗糖合成酶的质量比为(0.005-0.01)：1：(0.2-1)。可选地，当所述反应液中的所述二磷酸尿苷葡萄糖通过在所述反应液中直接加入时，所述二磷酸尿苷葡萄糖和所述甜菊苷的质量比为(0.001-1):1。进一步地，可选地，所述二磷酸尿苷葡萄糖和所述甜菊苷的质量比为(0.01-0.3):1。可选地，当所述混合原料包括所述二磷酸尿苷葡萄糖、蔗糖和蔗糖合成酶时，由于所述二磷酸尿苷葡萄糖在所述葡萄糖基转移酶催化下在所述反应液中得到尿苷二磷酸，所述蔗糖、所述蔗糖合成酶和是尿苷二磷酸可以反应生成二磷酸尿苷葡萄糖，并在所述反应液中形成所述二磷酸尿苷葡萄糖的循环再生体系。可选地，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥、大豆和马铃薯中的一种或多种。进一步地，可选地，所述蔗糖合成酶来源于拟南芥。可选地，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为10％-30％。进一步地，可选地，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为20％-30％。例如，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为10％，或为18％，或为25％，或为30％。可选地，所述甜菊糖原料与所述葡萄糖基转移酶的质量比为1：(0.1-1)；所述葡萄糖基转移酶的添加形式包括粗酶液或酶粉。所述葡萄糖基转移酶的粗酶液是指含有葡萄糖基转移酶的微生物破碎缓冲液，所述微生物可以合成所述葡萄糖基转移酶。所述葡萄糖基转移酶的酶粉是指所述葡萄糖基转移酶纯化后的冷冻干燥酶粉。可选地，所述反应液的反应温度维持在20-45℃。进一步地，可选地，所述反应液的反应温度维持在35-40℃。例如，所述反应液的反应温度维持在20℃，或为30℃，或为35℃，或为38℃，或为40℃。所述温度范围下的所述葡萄糖基转移酶的催化活性高，所述甜菊苷的转化率高。进一步地，可选地，本专利技术所述制备方法中，调节所述反应液的pH为7.0-8.0。例如，调节所述反应液的pH为7.2，或为7.4，或为8.0。可选地，所述搅拌反应的反应时间为4-25小时。所述搅拌反应的搅拌速率为200-300rpm。进一步地，可选地，所述搅拌反应的反应时间为10-20小时。例如，所述搅拌反应的反应时间为4小时，或为10小时，或为15小时，或为20小时。可选地，所述收集得到莱苞迪甙A的过程包括：对所述反应液加热以使所述葡萄糖基转移酶变性，过滤并收集滤液，将所述滤液纯化处理后得到莱苞迪甙A，其中，所述加热的温度为85-100℃，时间为0.3-1小时。所述莱苞迪甙A在纯化处理过程中会存在部分损失，纯化处理后得到的所述莱苞迪甙A的甜度、热量和理化性质均符合实际理论参数。可选地，所述反应液至少包括二磷酸尿苷葡萄糖再生体系时，所述甜菊苷与所述蔗糖的质量比为1：(0.2-1)。可选地，所述反应液中还包括缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的一种或多种。可选地，所述缓冲液的浓度为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种莱苞迪甙A的制备方法，其特征在于，包括：在二磷酸尿苷葡萄糖和葡萄糖基转移酶存在下，以甜菊糖原料为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为6.0‑8.0，在恒定温度20‑45℃下进行搅拌反应后，收集得到莱苞迪甙A；所述甜菊糖原料包括甜菊苷，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种莱苞迪甙A的制备方法，其特征在于，包括：在二磷酸尿苷葡萄糖和葡萄糖基转移酶存在下，以甜菊糖原料为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为6.0-8.0，在恒定温度20-45℃下进行搅拌反应后，收集得到莱苞迪甙A；所述甜菊糖原料包括甜菊苷，所述葡萄糖基转移酶的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖基转移酶的基因编码序列包括如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应液中的所述二磷酸尿苷葡萄糖通过在所述反应液中直接加入或通过在所述反应液中加入混合原料获得，所述混合原料包括尿苷二磷酸和所述二磷酸尿苷葡萄糖中的一种或两种、蔗糖和蔗糖合成酶。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述混合原料包括尿苷二磷酸、蔗糖和蔗糖合成酶时，所述尿苷二磷酸、所述蔗糖和所述蔗糖合成酶的质量比为(0.0001-0.04)：(0.1-2)：(0.1-1)。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅荣昭，李振伟，刘文山，刘玉凤，
申请(专利权)人：邦泰生物工程深圳有限公司，江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44