【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物学领域（酶催化方向），具体涉及一种高效酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法。
技术介绍
1、β-烟酰胺单核苷酸(简称nmn)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶nad+)的关键前体之一，体内体外及临床试验证明nmn具有抗衰老作用，特别是哈佛医学院davidsinclair教授研究发现22个月大的小鼠(相当于人类60岁)服用β-烟酰胺单核苷酸一周后，生理指标恢复到6个月状态(相当于人类20岁)，并延长了30％的寿命，令世人惊奇。同时，nmn对胰岛素的分泌也能起到调节作用，对mrna的表达水平也有影响。除此之外，nmn还具有防止老年痴呆症等作用。因而以nmn为活性成分的功能性保健品、食品、药物具有美好的市场前景和开发价值。。
2、传统的nmn的生产是采用化学合成，以烟酰胺和核糖为底物合成烟酰胺核糖，再经过磷酸化得到nmn。化学合成转化率低，工艺复杂，磷酸化特异性不高，导致产品中杂质过多，分离纯化极其困难，总体收率很低，同时有机溶剂使用量大，造成严重的环境污染、成本高。
3、微生物代谢法对代谢通路技术要求高，需要敲除影响代谢产物相关的基因，且部分基因难以敲除，另外还需要增强代谢通路中主要基因的过表达或者过表达转录蛋白等。这都需要消耗大量的时间、人力、物力以及财力，后期发酵工艺开发困难。最终得到的产物nmn量少，难以实现产业化。
4、生物酶法合成nmn主要以nr和atp为底物，在nrk酶的催化下合成nmn，现阶段单酶法产量较低且酶活偏低，生产过程中需要消耗大量的atp，由于atp价格昂贵从而增加
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，利用双酶法同时进行催化反应，进一步提高酶法合成nmn的产量，以满足生产的需要。其中ppk2是一个双功能酶，其作用是催化adp转化为atp，或者将amp催化成adp，再将adp转化为atp，使atp在反应体系中再生循环。nrk酶催化nr-cl和atp合成nmn，且酶活性较高，催化效率高。
2、本专利技术提供一种高效合成烟酰胺单核苷酸的重组菌，将ppk2基因和nrk基因转入大肠杆菌感受态细胞bl21（ed3）中构建重组菌。
3、作为优选的技术方案，将ppk2基因和nrk基因构建在同一个pet-28a(+)载体上，实现2个基因共表达，命名为pet-28a(+)-ppk2-nrk，将质粒pet-28a(+)-ppk2-nrk转到大肠杆菌感受态细胞bl21（ed3）构建重组菌，并进行诱导表达。
4、本专利技术提供一种高效酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法，将重组菌培养得到的含有ppk2酶和nrk酶的菌体加入破菌液，超声破碎，离心取上清，制作粗酶液。以nr-cl、atp、mgcl2、(napo3)6为底物，加入重组菌产生的含ppk2酶和nrk酶的粗酶液催化合成烟酰胺单核苷酸。其中ppk2催化adp转化为atp或者将amp催化成adp，再将adp转化为atp，使atp在反应体系中再生循环。nrk催化nr-cl和atp合成nmn。
5、作为优选的技术方案，以nr-cl、atp、mgcl2、(napo3)6为底物，加入重组菌产生的含ppk2酶和nrk酶的粗酶液浓度为1~4g/l，合成烟酰胺单核苷酸。
6、作为优选的技术方案，粗酶液浓度为3g/l。
7、作为优选的技术方案，以nr-cl、atp、mgcl2、(napo3)6为底物，加入重组菌产生的含ppk2酶和nrk酶的粗酶液，ph为5.5~8.0，合成烟酰胺单核苷酸。
8、作为优选的技术方案，ph为7.0。
9、作为优选的技术方案，以nr-cl、atp、mgcl2、(napo3)6为底物，加入重组菌产生的含ppk2酶和nrk酶的粗酶液，温度为35℃~45℃，合成烟酰胺单核苷酸。
10、作为优选的技术方案，温度为40℃。
11、作为优选的技术方案，nr-cl浓度为210mm~450 mm。
12、作为优选的技术方案，nr-cl浓度为390mm。
13、作为优选的技术方案，atp浓度为15mm~45 mm。
14、作为优选的技术方案，atp浓度为35mm。
15、作为优选的技术方案，(napo3)6浓度为35mm~85 mm。
16、作为优选的技术方案，(napo3)6浓度为75mm。
17、作为优选的技术方案，mgcl2浓度为20mm~100 mm。
18、作为优选的技术方案，mgcl2浓度为80 mm。
19、作为优选的技术方案，合成烟酰胺单核苷酸的反应条件为nr-cl浓度为390mm，atp浓度为35mm，mgcl2浓度为80 mm，(napo3)6浓度为75mm，粗酶液（含ppk2酶和nrk酶）蛋白浓度为3g/l，温度为40℃，ph为7.0。
20、作为优选的技术方案，反应时间为3h。
21、本专利技术提供一种高效合成烟酰胺单核苷酸的重组菌在食品、保健品、药品、化妆品或饲料领域制备含烟酰胺单核苷酸的产品中的应用。
22、有益效果
23、1、本专利技术将双功能的polyphosphate kinase 2（简写 ppk2）与高活性的nicotinamide riboside kinase（简写 nrk）基因实现共表达，并把共表达质粒转入大肠杆菌bl21（ed3）中构建全新的重组菌。
24、2、本专利技术将ppk2和nrk构建在同一个pet-28a(+)载体上，实现2个基因共表达，命名为pet-28a(+)-ppk2-nrk。这是一种新的共表达方法，与单酶相比，减少工艺操作步骤，节约资源，降低成本，尤其是发酵成本明显降低一半。
25、3、本专利技术以nr-cl、atp、mgcl2、(napo3)6为底物，加入重组菌产生的含ppk2酶和nrk酶进行催化反应，其中ppk2催化adp转化为atp，或者将amp催化成adp，再将adp转化为atp。使atp在反应体系中再生循环，从而降低atp的量，也减少副产物的生成，nrk催化nr-cl和atp合成nmn，提高酶法合成nmn的产量。
26、4、本专利技术的方法nmn的产量达到了127.6g/l，转化率高达99.5%以上，收率95%以上，3h即可反应结束，大大缩短了反应时间。
27、5、本专利技术筛选到的nrk酶活性是现阶段酶活力最高的，能实现高产量nmn的催化合成。ppk2和nrk基因在大肠杆菌中共表达生产的粗酶液稳定性好，酶活力高发酵易控制，发酵稳定。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种高效合成烟酰胺单核苷酸的重组菌，其特征在于，将双功能的PPK2基因和NRK基因转入大肠杆菌BL21（ED3）中构建重组菌，所述PPK2基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述NRK基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述PPK2基因和NRK基因在pET-28a(+)载体中以共表达的方式构建质粒pET-28a(+)-PPK2-NRK转入大肠杆菌感受态细胞BL21（ED3）。
3.一种高效酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，以NR-CL、ATP、MgCL2、(NaPO3)6为底物，加入权利要求1或2所述的重组菌产生的PPK2酶和NRK酶，合成烟酰胺单核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以NR-CL、ATP、MgCL2、(NaPO3)6为底物，加入权利要求1或2所述的重组菌产生的含有PPK2酶和NRK酶的粗酶液浓度为1~4g/L，PH为5.5~8.0，温度为35℃~45℃，合成烟酰胺单核苷酸。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述NR
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ATP浓度为15mM~45 mM。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述(NaPO3)6浓度为35mM~85 mM。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述MgCL2浓度为20mM~100 mM。
9.根据权利要求3~8任一所述的方法，所述NR-CL浓度为390mM，所述ATP浓度为35mM，所述MgCL2浓度为80mM，所述(NaPO3)6浓度为75mM，所述的重组菌产生的含有PPK2酶和NRK酶的粗酶液浓度为3g/L，温度为40℃，pH为7.0。
10.权利要求1或2所述的重组菌在食品、保健品、药品、化妆品或饲料领域制备含烟酰胺单核苷酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高效合成烟酰胺单核苷酸的重组菌，其特征在于，将双功能的ppk2基因和nrk基因转入大肠杆菌bl21（ed3）中构建重组菌，所述ppk2基因的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述nrk基因的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述ppk2基因和nrk基因在pet-28a(+)载体中以共表达的方式构建质粒pet-28a(+)-ppk2-nrk转入大肠杆菌感受态细胞bl21（ed3）。
3.一种高效酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，以nr-cl、atp、mgcl2、(napo3)6为底物，加入权利要求1或2所述的重组菌产生的ppk2酶和nrk酶，合成烟酰胺单核苷酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以nr-cl、atp、mgcl2、(napo3)6为底物，加入权利要求1或2所述的重组菌产生的含有ppk2酶和nrk酶的粗酶液浓度为1~4g...
【专利技术属性】
技术研发人员：王国红，刘倩敏，舒尚科，高升，郭帅印，周志刚，张琦，
申请(专利权)人：邦泰生物工程深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。