一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体、其应用及其制备莱鲍迪苷D的方法技术

提供了一种UDP‑葡萄糖基转移酶突变体、其应用及制备莱鲍迪苷D的方法，对野生型UDP‑葡萄糖基转移酶的基因序列进行定点突变，获得了包括SEQ ID NO：3在内的一系列突变体，这些突变体的酶活力和pH稳定性较野生型亲本得到提高。

A UDP glucosyltransferase mutant, its application and its preparation method of leibaodi glycoside D

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体、其应用及其制备莱鲍迪苷D的方法
本专利技术涉及生物酶
，特别涉及一种通过基因定点突变的方法人工获得的UDP-葡萄糖基转移酶突变体及其用于催化制备莱鲍迪苷D的方法。
技术介绍
葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶，该酶的作用机理是催化糖基供体的葡萄糖残基转移到糖基受体分子上，从而调节受体分子的活性。UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，简称UGT)是葡萄糖基转移酶中的一种，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，几乎存在于所有有机体中。UDP-葡萄糖是二磷酸尿苷葡糖(uridinediphosphateglucose)的简称，又简称为UDP-葡糖或者UDPG，是由尿苷二磷酸和葡萄糖组成的维生素，可看作“活性葡萄糖”，广泛分布于植物、动物和微生物的细胞内，在蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖合成中作葡萄糖基的供体，是最常见的一种糖基供体。如今，随着天然甜味剂甜菊糖苷的广泛应用，以及生物催化技术的日益发展，UDP-葡萄糖基转移酶被越来越多地应用在甜菊糖苷的生物催化制备的领域中来。UDP-葡萄糖基转移酶的种类很多，目前甜菊糖苷的生物酶法制备领域中使用的酶多为来源于植物细胞中的野生酶，这种野生酶往往存在酶活低、稳定性差等缺点，从而导致应用于工业化大生产制备甜菊糖苷的成本较高。因此，有必要对UDP-葡萄糖基转移酶的野生酶进行改造，从而获得酶活更高、稳定性更好的改造酶，以便更好地服务于工业化大生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决野生型UDP-葡萄糖基转移酶酶活力低、稳定性差的技术问题，开发一种酶活力及稳定性更高的UDP-葡萄糖基转移酶。为实现上述目的，本专利技术提供了一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体，该突变体为如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：(a)氨基酸序列如SEQIDNO：3所示的蛋白质；(b)在如SEQIDNO：3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)限定的蛋白质的氨基酸序列具有90％以上同源性并且具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的蛋白质。优选地，与如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本专利技术提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体在至少一个如下位点处有突变：第69位、第148位、第244位、第251位、第252位、第255位、第368位、第426位和第432位。更优选地，与如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本专利技术提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体具有至少一个如下突变：A69D、M148L、F244P、L251S、H252P、R255G、M368L、S426R、K432N。更优选地，与如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本专利技术提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的突变为A69D、M148L、F244P、R255G、M368L、S426R、K432N或L251S/H252P。同时，本专利技术还提供了一种生物材料，包括重组载体、重组细胞或者重组微生物，该生物材料含有编码本专利技术提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的基因序列，在合适的条件下，该生物材料能够表达分泌出本专利技术提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体。同时，本专利技术还提供了上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的用途，该用途为将本专利技术提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体应用于制备甜菊糖苷中，特别地，将本专利技术提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体应用于制备莱鲍迪苷D中。优选地，本专利技术提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的用途为：在UDPG存在的条件下，用上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D。另外，本专利技术还提供了一种制备莱鲍迪苷D的方法，该方法包括：在蔗糖、UDP和蔗糖合成酶存在的条件下，用UDP-葡萄糖基转移酶催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D，其中，UDP-葡萄糖基转移酶为氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本或者是本专利技术提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体，蔗糖合成酶来源于拟南芥<Arabidopsisthaliana>的AtSUS基因，该基因已被收录在NCBI数据库中，其登录号为NP_197583。上述方法中，UDP是尿苷二磷酸(Uridinediphosphate)的英文缩写，是合成UDPG的物质之一。优选地，本专利技术提供的上述方法中，催化反应过程在水环境中进行，催化反应的pH值为4～9，催化反应的温度为4～45℃。更优选地，催化反应的pH值为7～8，催化反应的温度为35～45℃。优选地，本专利技术提供的上述方法中，莱鲍迪苷A在反应体系中的终浓度为10-50g/L。有益效果：1、与UDP-葡萄糖基转移酶亲本相比，本专利技术提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体在酶活力和pH稳定性方面均得到了较为明显的提高，特别是酶活力至少提高了200％。2、应用本专利技术提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体开发的制备莱鲍迪苷D的方法，在确保底物莱鲍迪苷A的转化率高达97％以上的同时可大大减少酶的使用量。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以下实施例是对本专利技术的解释，本专利技术并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。若无特别说明，本专利技术实施例中所使用的原料及试剂皆为市售商品。1、亲本质粒的制备根据来源于水稻(OryzasativaJaponicaGroup)的UDP-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列(GenBank登录号：XP_015629141.1)合成所需基因片段，连入pET28a载体，两端酶切位点分别为BamHI和HindIII，得到UDP-葡萄糖基转移酶亲本质粒，再将获得的亲本质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞DE3，经Amp筛选后挑取菌落进行测序，确定该被克隆的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2、突变体的制备根据亲本基因序列设计引物，通过反向PCR技术分别对UDP-葡萄糖基转移酶亲本的第69位、第148位、第244位、第251、252位、第255位、第368位、第426位和第432位进行定点突变。利用表1中各突变位点对应的上下游引物，以第1部分制备得到的亲本质粒为模板，分别进行反向PCR扩增，PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序如下：PCR扩增反应体系：PCR扩增反应程序：98℃2min；98℃10s；50-65℃30s；72℃7min；30个循环；最后72℃10min。表1...

【技术保护点】
一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于：所述突变体为如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：/n(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；/n(b)在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的由(a)衍生的蛋白质；/n(c)与(a)限定的蛋白质的氨基酸序列具有90％以上同源性并且具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于：所述突变体为如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)氨基酸序列如SEQIDNO：3所示的蛋白质；
(b)在如SEQIDNO：3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的由(a)衍生的蛋白质；
(c)与(a)限定的蛋白质的氨基酸序列具有90％以上同源性并且具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的蛋白质。


根据权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，与如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，所述突变体在至少一个如下位点处有突变：第69位、第148位、第244位、第251位、第252位、第255位、第368位、第426位和第432位。


根据权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，与如SEQIDNO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，所述突变体具有至少一个如下突变：A69D、M148L、F244P、L251S、H252P、R255G、M368L、S426R、K432N。


根据权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于：与如SEQIDNO：2所示的UDP-...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅荣昭，刘文山，刘玉凤，李振伟，
申请(专利权)人：邦泰生物工程深圳有限公司，江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司，江西安泽麦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44