新型O-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体及使用其生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法技术

本申请涉及O‑琥珀酰高丝氨酸转移酶变体、编码其的多核苷酸、包括变体的微生物、以及使用该微生物生产O‑琥珀酰高丝氨酸的方法。

A novel o-succinylhomoserine transferase variant and its application in the production of o-succinylhomoserine

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型O-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体及使用其生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法
本公开涉及O-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体、编码该变体的多核苷酸、包含该变体的微生物、以及使用该微生物生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法。
技术介绍
O-琥珀酰高丝氨酸充当甲硫氨酸(其是生物体内一种必需氨基酸)的前体。甲硫氨酸被用作饲料和食品添加剂，以及进一步被用作医用溶液和医疗用品的合成原料。甲硫氨酸通过化学合成和生物合成生产。同时，公开了两步法(WO/2008/013432)，其中通过发酵生产L-甲硫氨酸前体，然后通过酶转化反应将其转化为L-甲硫氨酸。在两步法中，O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸被用作甲硫氨酸的前体，且为了经济地大量生产甲硫氨酸，以高产率生产O-琥珀酰高丝氨酸是至关重要的。metA基因是编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶(MetA)(其是通过将琥珀酰辅酶A的琥珀酰基结合到高丝氨酸以生产O-琥珀酰高丝氨酸的酶)的基因，且metA基因是O-琥珀酰高丝氨酸生产菌株的开发中最重要的基因之一。通过缺失编码甲硫氨酸生物合成途径中的胱硫醚γ合酶的metB基因，可能制备出积累O-琥珀酰高丝氨酸的菌株。然而，O-琥珀酰高丝氨酸生产菌株对L-甲硫氨酸有需求。为了这个原因，高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的活性通过被添加到培养基中的甲硫氨酸的反馈抑制而被抑制，且最终难以获得高浓度的O-琥珀酰高丝氨酸。因此，许多先前的专利将它们的研究集中在从反馈控制系统解除metA的反馈抑制上。然而，metA编码的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶存在的问题在于野生型蛋白本身具有低稳定性，并且为了解除反馈抑制而引入突变加剧了不稳定性。因此，为了开发具有高生产能力的O-琥珀酰高丝氨酸生产菌株，需要移除metA基因的反馈抑制并保证酶的稳定性。已知自然界中存在的大多数微生物利用O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸作为中间体用于甲硫氨酸的生物合成。通常，MetA产生O-琥珀酰高丝氨酸，且高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetX)产生O-乙酰高丝氨酸。与MetA不同，MetX不受反馈抑制，并且具有很高的酶稳定性。
技术实现思路
技术问题本专利技术人为增加O-琥珀酰高丝氨酸的生产进行了集中努力，且结果，他们发现了具有O-琥珀酰高丝氨酸合成活性的蛋白质，从而完成了本公开。技术方案本公开的目的是提供具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，多肽包括对SEQIDNO：1的氨基酸序列中的第313位的氨基酸进行亮氨酸以外的氨基酸的取代。本公开的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。本公开的另一个目的是提供棒杆菌属(genusCorynebacterium)的O-琥珀酰高丝氨酸生产微生物，该微生物包含具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽。本公开的另一个目的是提供生产O-琥珀酰高丝氨酸的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养微生物；以及从培养的微生物或培养基中分离或收集O-琥珀酰高丝氨酸。本公开的另一个目的是提供生产L-甲硫氨酸的方法，该方法包括以下步骤：在培养基中培养微生物；以及使O-琥珀酰高丝氨酸与硫化物反应。有益效果根据本公开的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶蛋白的变体可具有与其天然形式相比增强的O-琥珀酰高丝氨酸转化活性，从而(作为现有化学合成途径的替代)广泛应用于O-琥珀酰高丝氨酸的更有效的大量生产。具体实施方式以下，将更详细地描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方式还可应用于其它描述和实施方式。换句话说，本公开中公开的各种要素的所有组合落入在本公开的范围内。进一步，本公开的范围不受下面描述的具体描述的限制。进一步，本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或确认本公开中描述的本公开的某些方面的许多等同物。同样，这样的等同物意图被包含在本公开中。为了实现这些目的，本公开的一个方面提供了具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的新型多肽。新型多肽变体可以是具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，多肽包括将来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的氨基酸序列中(具体地，SEQIDNO：1的氨基酸序列中)的第313位的氨基酸被亮氨酸以外的氨基酸取代。进一步，多肽可以包括在SEQIDNO：1的氨基酸序列中的第313位处被亮氨酸以外的氨基酸的取代，并且可以具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性。更具体地，多肽可以是具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，其中多肽包括在SEQIDNO：1的氨基酸序列中的第313位的氨基酸被精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸或赖氨酸的取代，但不限于此。这种多肽变体的特征在于，与SEQIDNO：1的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽相比，具有增强的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性。如本文所用，术语“O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性”是指将高丝氨酸转化成O-琥珀酰高丝氨酸的活性。O-琥珀酰高丝氨酸转移酶统称为能够将琥珀酰辅酶A和L-高丝氨酸作为底物转化成辅酶A和O-琥珀酰高丝氨酸的酶。[反应式]琥珀酰辅酶A+L-高丝氨酸辅酶A+O-琥珀酰高丝氨酸在本公开中，O-琥珀酰高丝氨酸转移酶是指具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的酶，其通过将作为O-乙酰高丝氨酸转移酶的MetX蛋白的氨基酸序列的部分取代为另一种氨基酸而获得。MetX蛋白可以是来源于棒杆菌属的MetX，且更具体地，可以是来源于谷氨酸棒杆菌的具有SEQIDNO：1的氨基酸序列的MetX，但不限于此。MetX蛋白可从作为已知数据库的NCBIGenBank获得。在本公开中，本领域已知的各种方法可应用于获得O-琥珀酰高丝氨酸转移酶的方法。对于其方法的实例，通过使用基于可以高产率获得酶的密码子优化的基因合成技术或通过使用基于关于微生物的大量基因组信息的生物信息学方法筛选有用的酶资源的方法，O-琥珀酰高丝氨酸转移酶可从已广泛用于酶的表达的棒杆菌属的微生物中获得，但不限于此。在本公开中，O-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体可与“突变的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶”或“变体O-琥珀酰高丝氨酸转移酶”互换使用。同时，变体可能是非自然发生的变体。具体地，本公开的突变的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶可以具有从来源于具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的棒杆菌属(Corynebacteriumsp.)的MetX的N端第313位的氨基酸残基被亮氨酸以外的氨基酸取代。具体地，第313位的亮氨酸氨基酸残基可以被精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、或赖氨酸取代，但不限于此。本公开的突变的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶可包括在从SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的N端第313位处包含变异的多肽，其中该变异包括选自精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸和赖氨酸的氨基酸的取代，并且多肽可与SEQIDNO：1具有至少85％的同源性或同一性，但不限于此。进一步，本公开的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽可以是选自SEQIDNO:59、SEQIDNO:67、SEQIDNO:75和SEQIDNO:81本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，所述多肽包含亮氨酸以外的氨基酸对SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第313位的氨基酸的取代。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 KR 10-2017-00834381.具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，所述多肽包含亮氨酸以外的氨基酸对SEQIDNO:1的氨基酸序列中第313位的氨基酸的取代。


2.权利要求1所述的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，其中所述第313位的氨基酸被精氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、或赖氨酸取代。


3.权利要求1所述的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽，其中所述多肽包含选自SEQIDNO:59、SEQIDNO:67、SEQIDNO:75和SEQIDNO:81的氨基酸序列的任一氨基酸序列。


4.编码权利要求1所述的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽的多核苷酸。


5.权利要求4所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自SEQIDNO:60、SEQIDNO:68、SEQIDNO:76和SEQIDNO:82的核酸序列的任一核酸序列。


6.棒杆菌属(genusCorynebacterium)的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其中包含或过表达权利要求1所述的具有O-琥珀酰高丝氨酸转移酶活性的多肽或其变体多肽。


7.权利要求6所述的棒杆菌属的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其中与非变体微生物相比天冬氨酸激酶活性被进一步增强。


8.权利要求6所述的棒杆菌属的产生O-琥珀酰高丝氨酸的微生物，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：金径林，沈知炫，金贤雅，申容旭，P·李，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR