一种高纯度α-环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高纯度α-环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法，本发明专利技术采用以下步骤实现：首先进行α-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液制备、再进行发酵上清液饱和硫酸铵沉淀、进行离子交换柱层析、进行Native-PAGE电泳分离、再进行目标蛋白的电泳回收，即可得到高纯度的α-环糊精葡萄糖基转移酶酶。与现有技术相比，本发明专利技术制备出的α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯度高且制备步骤少，生产效率高，能够满足环糊精工业化生产的要求，减少了环糊精后期提纯的难度，使得环糊精的生产成本大大降低，极大地提高了CGTase的应用和环糊精的规模化生产，具有推广应用的价值。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种高纯度α?环糊精葡萄糖基转移酶的简单制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：进行α?环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液制备：α?环糊精葡萄糖基转移酶产生菌经96h发酵后，对发酵液进行离心处理，收集上清液即为粗酶液；步骤二：进行发酵上清液饱和硫酸铵沉淀：冰浴条件下，往发酵上清液中加入已研碎的硫酸铵直至饱和度为90%，4℃冰箱放置沉淀过夜；第二天离心收集沉淀，收集的沉淀经Tris?HCl?Buffer复溶后于4℃冰箱中透析除盐；步骤三：进行离子交换柱层析：取适量透析保留液进行DEAE?Sepharose?Fast?flow离子交换柱层析，离子交换柱用含0.04M?NaCl的Tris?HCl?Buffer平衡，用含0.1M?NaCl的Tris?HCl?Buffer进行洗脱，流速设定为0.5ml/min，采用部分收集器收集馏分，每3ml收集1管，碘显色法确定具有酶活性的馏分，并对活性馏分进行冷冻干燥；步骤四：进行Native?PAGE电泳分离：冷冻干燥样品经最小体积的上样缓冲液复溶后进行Native?PAGE电泳分离，电泳结束后切取部分凝胶进行R?250染色和活性染色以进行目标蛋白的定位；步骤五：进行目标蛋白的电泳回收：确定目标蛋白在凝胶中的位置后，将包含目标蛋白的凝胶切下并放入透析袋内，往透析袋内加入适量的电极液即可进行电泳回收，期间隔几个小时收集已电泳出来的组分，将电泳出的组分合并于透析袋内透析以去除电极液中高浓度的甘氨酸组分，透析采用磷酸盐缓冲液；透析保留液冷冻干燥即可获得高纯度的α?环糊精葡萄糖基转移酶酶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈济琛，林新坚，叶学军，林陈强，张慧，
申请(专利权)人：福建省农业科学院土壤肥料研究所，
类型：发明
国别省市：