一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母制造技术

本发明专利技术公开了一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母，属于生物工程技术领域。本发明专利技术以Pichia pastoris GS115为宿主、pPICZα为载体表达干酪乳杆菌来源的精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。本发明专利技术通过表达原核来源的精氨酰琥珀酸裂解酶基因，有效提高了真核微生物的酸胁迫抗性。本发明专利技术还优化了精氨酰琥珀酸裂解酶的氨基酸序列，发现优化后的序列能够更高幅度地提高毕赤酵母的耐酸水平。

【技术实现步骤摘要】
一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母
本专利技术涉及一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母，属于生物工程

技术介绍
在利用有机酸生产菌株，发酵生产有机酸的过程中，随着有机酸的积累，胞外pH不断下降，有机酸的解离度也持续下降从而以未解离态进入细胞。细胞质中较高的pH使得有机酸解离，释放出质子不断积累，最终导致细胞质酸化并影响细胞代谢的代谢和生长从而影响发酵过程。在工业生产中，通常加入大量NaOH、CaCO3等中和剂以维持培养基的pH稳定。但中和剂的添加也导致了发酵液的渗透压升高和后期产物纯化成本增加。因此提高微生物的有机酸耐受性是提高产量的途径之一。毕赤酵母具有表达蛋白易于纯化，产量高等优点，因此使用较为广泛。但是毕赤酵母对酸胁迫的耐受能力较差，不利于研究毕赤酵母作为发酵产酸菌株。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术提供了一种提高毕赤酵母酸胁迫抗性的方法，所述方法是以PichiapastorisGS115为宿主、pPICZα为载体表达干酪乳杆菌来源的精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。在一种实施方式中，所述ArgH的氨基酸序列是SEQIDNO.1或者SEQIDNO.2所示的序列。本专利技术的第二个目的是提供了一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌以PichiapastorisGS115为宿主、pPICZα为载体表达干酪乳杆菌来源的精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。在一种实施方式中，所述毕赤酵母基因工程菌的构建方法，如下：(1)通过PCR方法或者化学合成的方法获得精氨酰琥珀酸裂解酶基因；(2)将步骤(1)获得的精氨酰琥珀酸裂解酶基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα上，得到重组质粒pPICZα-ArgH；(3)将步骤(2)获得的重组质粒pPICZα-ArgH电转入PichiapastorisGS115得到表达精氨酰琥珀酸裂解酶的基因工程菌株。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术通过表达原核来源的精氨酰琥珀酸裂解酶基因，有效提高了真核微生物的酸胁迫抗性。(2)本专利技术还优化了精氨酰琥珀酸裂解酶的氨基酸序列，发现优化后的序列能够更高幅度地提高毕赤酵母的耐酸水平。具体实施方式BMGY培养基(g/L)：酵母粉10g，胰蛋白胨20g，甘油20g，(NH4)2SO410g，YNB3.4g，1moL/LKH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH6.0)100mL，生物素4×10-5g；BMMY培养基(g/L)：酵母粉10g，胰蛋白胨20g，(NH4)2SO410g，YNB3.4g，1moL/LKH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH6.0)100mL，生物素4×10-5g。实施例1：重组菌的构建(1)重组质粒pMD19-T-ArgH的构建采用化学合成或者PCR的方法，得到含有编码氨基酸序列为SEQIDNO.1或者SEQIDNO.2的基因片段，然后将基因片段连接到pMD19-T质粒上，并转化大肠杆菌，验证正确的转化子，得到重组质粒pMD19-T-ArgH。抽提pMD19-T-ArgH和pPICZα质粒，然后双酶且pMD19-T-ArgH和pPICZα质粒4h，0.7％琼脂糖凝胶电泳分析。利用割胶回收试剂盒回收目的片段，16℃连接4h后，利用化学转化法，转化大肠杆菌DH5α。筛选正确的转化子，得到重组质粒pPICZα-ArgH。(2)毕赤酵母基因工程菌的构建以SacI线性化的表达载体pPICZα-ArgH电转化PichiapastorisGS115。将验证正确的菌株保种，得到毕赤酵母基因工程菌PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH。其中酵母感受态的制备方法如下：(a)从新鲜YPD平板上挑取毕赤酵母菌落于25mLYPD液体培养基中，30℃，200r/min培养20h；(b)将0.5mL上述培养液转接到25mLYPD液体培养基中，30℃，200r/min培养8h(大约OD600＝1.3-1.5)；(c)吸取1mL上述菌液于1.5mL无菌的EP管中，4000r/min离心2min，收集菌体，用1.5mL预冷的无菌水，吹打悬浮细胞；(d)4000r/min离心2min，收集菌体，用1mL预冷的无菌水重新悬浮细胞；(e)4000r/min离心2min，收集菌体，用1.5mL预冷的1moL/L山梨醇悬浮细胞；(f)4000r/min离心2min，收集菌体，用100μL预冷的1moL/L山梨醇混匀细胞，5min后方可使用。电穿孔转化法如下：(I)提前预热电穿孔仪；(II)取80μL酵母感受态细胞与20μL线性化的表达载体，轻轻混匀，冰浴5min；后转入预冷的0.2cm电击杯中；(III)将电击杯外水汽彻底擦干净，放入电击室；(IV)按电转参数：1.5kV，25μF，200，5ms进行电击；(V)电击后立即加入1mL预冷的1moL/L山梨醇于电击杯中，轻轻吹打后，将内容物全部转入无菌的1.5mLEP管中，于30℃复活培养1h；(VI)4000r/min离心5min，去除750μL上清液，将剩余的菌液涂布到含有100μg/mLzeocin的YPDS平板上，30℃培养3-5d。按照上述方法，得到了2株毕赤酵母基因工程菌PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH1(表达氨基酸序列如SEQIDNO.1的酶)、PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH2(表达氨基酸序列如SEQIDNO.2的酶)。实施例2ArgH蛋白的诱导表达与检测(a)将实施例1得到的2株毕赤酵母工程菌分别取单菌落接种于50mL生长培养基BMGY/500mL三角瓶中，30℃，200r/min培养20h；(b)将上述BMGY生长培养基中的菌液，室温静置1h，弃掉上清液，用30mLBMMY培养基重新悬浮菌体，加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，30℃，200r/min培养，每隔24h补加100％甲醇至终浓度为1％(v/v)进行诱导48h。并用SDS-PAGE蛋白电泳检测毕赤酵母工程菌中ArgH蛋白得到表达。实施例3酸胁迫下生长性能试验对于考察菌株在胁迫条件下的生长情况，将毕赤酵母基因工程菌PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH1、PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH2接种于BMGY生长培养基中的菌液，室温静置1h，弃掉上清液，用30mLBMMY培养基重新悬浮菌体，加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，30℃，200r/min培养，诱导12h。然后将诱导后的菌株接种至新鲜的BMMY培养基中，其中BMMY培养基用乳酸调节至pH5.0。分别测定PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH1、PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH2在胁迫条件下的生长性能，以不表达外源基因的PichiapastorisGS115-pPICZα为对照。结果显示，经生长性能试验分析，PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH1菌株相对于PichiapastorisGS115-pPICZα生物量有约48％的提高，PichiapastorisGS115-pPICZα-ArgH2菌株相对于PichiapastorisGS115-pPICZα生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高毕赤酵母酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是以Pichia pastoris GS115为宿主、pPICZα为载体表达干酪乳杆菌来源的精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。

【技术特征摘要】
1.一种提高毕赤酵母酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是以PichiapastorisGS115为宿主、pPICZα为载体表达干酪乳杆菌来源的精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ArgH的氨基酸序列是SEQIDNO.1或者SEQIDNO.2所示的序列。3.一种酸胁迫抗性提高的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母基因工程菌以PichiapastorisGS115为宿主、pPICZα为载体表达干酪乳杆菌来源的精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。4.根据权利要求3所述的毕赤酵母基...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴银娣，
申请(专利权)人：吴银娣，
类型：发明
国别省市：江苏,32