全细胞生物催化剂制造技术

本发明专利技术涉及包含编码信号肽的区段、包含异源氧化还原因子再生多肽的区段、任选地编码蛋白酶识别位点的区段、编码跨膜接头的区段、和编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段的核酸分子。该核酸分子使得能够表达氧化还原因子再生酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】全细胞生物催化剂本专利技术涉及包含以下的核酸分子:(I)编码信号肽的区段、(2)包含异源氧化还原因子再生多肽或其变体的区段、(3)任选的编码蛋白酶识别位点的区段、(4)编码跨膜接头的区段、和(5)编码自主转运蛋白(autotransporter)或其变体的转运蛋白结构域的区段。所有已知酶的大约四分之一是氧化还原酶。对这一组酶已经开发了宽范围的应用，包括手性化合物诸如醇类、醛类和氨基酸的合成，聚合物的产生和改性，用于最为多样的应用的生物传感器的产生，和有害物质的降解。氧化还原酶的特征在于，它们不仅包括至少一条多肽链，而且包括一个或多个氧化还原反应性基团，其可以是一个或多个氧化还原反应性氨基酸侧链或辅基。氧化还原酶的底物包括代谢产物和氧化还原因子。不同于酶的辅基，这些氧化还原因子底物不作为催化剂起作用，而是以化学计量的量参与反应，并与其他底物一起进入化学反应。由于氧化还原因子通常比其他有机底物昂贵得多的事实，使用氧化还原酶的工业合成的可行性受到限制，由于需要提供合适的还原因子或氧化因子。为了解决这一问题，科学家们已经建议使用氧化还原因子再生酶。例如，已经提出使用甲酸脱氢酶(FDH)和NADH氧化酶或使用葡萄糖脱氢酶(GDH)来再生NADH或NADPH。将这样的酶固定在合适的载体上用于多个催化循环应当是可能的，以避免不得不重复地纯化大量的多肽。不幸地，氧化还原因 子再生酶通常是不稳定的，尤其是当处于固定化酶的形式时。Sanjust等(1997)将来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的NADH氧化酶固定在多种载体上，并比较了可溶性和固定化酶的动力学特性。发现，固定化酶具有比可溶性酶低的热稳定性。Hmnmel和Riebel (2003)描述了使用来自短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)的可溶性、纯化的NADH氧化酶用于再生NADH氧化酶。他们证明，该酶具有朝向快速氧化失活的趋势，很可能是因为蛋白催化中心中存在对氧化敏感的半胱氨酸残基。因此，还原剂(ImM DTT或巯基乙醇)的使用被描述为对于维持该酶的催化能力是重要的。Ahmed和 Claiborne (1992)从粪链球菌(Streptococcus faecalis) 10C1 纯化了含 FAD 的 NADH氧化酶并教导，2mM DTT的存在对于稳定全氧化酶(holo_oxidase)是必需的。El-Zahab等(2004)描述，并由Lee和Ping (2007)证实，将氧化还原因子再生酶例如葡萄糖脱氢酶(GDH)固定在固态载体上，狭义地固定在纳米孔石英玻璃上。然而，他们没有描述所述酶如何能够被稳定。因此本专利技术的目的是提供具有氧化还原因子再生活性的剂，其中活性的来源不仅对于底物分子是容易接近的，而且可被容易地扩增、回收和再生，使得多个催化步骤是可能的，而不需要重复地产生新鲜的剂。本专利技术的另一目的是提供一种剂，其本身或在存在可能失活性的化学物诸如抑制性金属离子时或在酸性或碱性PH，具有氧化还原因子再生活性和在动力学、热稳定性、储存能力和稳定性方面比对应的酶的原始形式更佳的特性。本专利技术的特殊目的是提供一种剂，其在存在氧或氧释放剂时或在氧化条件下表现稳定的氧化还原因子再生活性，其稳定性比对应的酶的原始形式更佳。本专利技术人令人惊讶地发现，使用自主转运蛋白系统，能够在全细胞的表面上表达氧化还原因子再生酶，且这些酶自身在存在氧和不同温度和条件时是令人惊讶地稳定的。而且，本专利技术人令人惊讶地发现，能够在多种条件中在多种溶液和缓冲液中培养氧化还原因子再生酶并在相当长的时间保持稳定。自主展示(autodisplay)是在细菌表面上呈递重组蛋白的精细工具。这一表达系统是基于属于V型分泌系统的自主转运蛋白的蛋白家族的分泌机制。在革兰氏阴性细菌中，自主转运蛋白途径由向细胞表面转运蛋白和向细胞外空间分泌蛋白二者形成(Jose和Meyer，2007)。自主转运蛋白作为前体蛋白被合成，其满足向细胞表面转运的所有结构要求(JoSe，2006)。它们被合成为带有N末端信号肽，这是Sec途径典型的，这使得跨过内膜成为可能。一旦在周质之内，截短信号肽之后，前体的C末端部分折叠进入外膜作为孔蛋白样结构，即所谓的￠-桶。经过这个孔，N末端结合的载客结构域(passenger domain)移位到表面(Jose等,2002)。在那里其可以被切割_通过自动蛋白水解或另外的蛋白酶-或能够经由转运蛋白结构域保持锚定在胞外被膜(cell envelope)上。用重组蛋白代替天然的载客导致重组蛋白的表面移位(surface translocation)。为此，必须使用遗传工程技术构建由信号肽、重组载客、￠-桶和其间的接头区域组成的非天然的前体，接头区域是不受限制地接近表面所需的。以这种方式，AIDA-1自主转运蛋白已经成功地被用于多种载客结构域的有效表面展示(Henderson等,2004)。利用自主展示系统，已经观察到活性酶上亚基的自缔合，例如对于二聚酶山梨糖醇脱氢酶(JoSe，2002 Jose和von Schwichow,2004) 具体地，自主展示技术是在大肠杆菌(E.coli)和其他革兰氏阴性细菌的外膜表面上表达某些蛋白的方法，其中自主展示系统基于自主转运蛋白的天然分泌机制(A.Banerjee等(2002))。重组载客蛋白的转运可简单地通过使用常规遗传工程技术在读码框中在自主展示载体的信号肽与移位结构域之间插入其编码序列来进行。信号肽可以从霍乱毒素的亚基获得，且其可以与非天然启动子联合。从而，将要经历跨外膜的移位的载客蛋白作为与另一蛋白的重组融合蛋白，称为自主转运蛋白，被表达在大肠杆菌的外膜上(AIDA-1)(J0Se，2006)。自主转运蛋白的C末端部分在大肠杆菌的外膜中形成孔蛋白样结构(￠-桶)。这种孔蛋白样结构使得重组载客蛋白能够被移位到大肠杆菌的外膜表面(Jose,1995，2006，2007)。固定氧化还原辅因子再生多肽的概念追溯到1974年，当时Sarborsky和Ogletree描述了经由活化其碳水化合物残基来固定葡萄糖氧化酶。自主展示系统的概念由Jose等(1995)首次描述，也已经被公知超过15年。尽管如此，就我们所知，使用自主转运蛋白系统来固定氧化还原因子再生酶没有被现有技术教导或提出。本专利技术的目的通过独立权利要求的目的来解决。优选的实施方案可见于从属权利要求。根据第一方面，本专利技术的目的如下解决，其还是第一方面的第一实施方案:一种核酸分子，包含(I)编码信号肽的区段、(2)包含异源氧化还原因子再生多肽或其变体的区段、(3)任选的编码蛋白 酶识别位点的区段、(4)编码跨膜接头的区段、和(5)编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段。在本专利技术优选的实施方案中，核酸分子被有功能地连接于表达调节序列。在优选的实施方案中，本文使用的术语“表达调节序列”是指能够调节核酸分子的表达水平的核酸序列，核酸分子优选地在表达调节序列下游。表达调节序列可以是例如启动子。本领域技术人员熟悉适于调节表达的序列和用于有功能地将这些序列与核酸分子连接的方法。在本专利技术优选的实施方案中，核酸分子是重组质粒的部分。在优选的实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:1或其变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.27 DE 10201003570221.一种核酸分子，包含以下组成部分: (1)编码信号肽的区段， (2)包含异源氧化还原因子再生多肽的区段， (3)任选的编码蛋白酶识别位点的区段， (4)编码跨膜接头的区段，和 (5)编码自主转运蛋白或其变体的转运蛋白结构域的区段。2.如权利要求1所述的核酸分子，其中由所述氧化还原因子再生多肽再生的所述氧化还原因子选自包括以下的组:NADH、NADPH、FADH2、血红素、金属离子、谷胱甘肽、吡咯并喹啉-醌、磷酸吡哆醛、焦磷酸硫胺素和抗坏血酸。3.如权利要求1或2之一所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽包括一种或多种黄素辅因子。4.如权利要求1至3之一所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:NADH氧化酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶。5.如权利要求4所述的核酸分子，其中所述氧化还原因子再生多肽选自包括以下的组:短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、短杆菌属(Brevibacterium)物种KU139和幾链球菌(Streptococcus faecalis)的NADH氧化酶,优选地短乳杆菌的NADH氧化酶,和其变体。6.如权利要求1 至5之一所述的核酸分子，其中所述自主转运蛋白的转运蛋白结构域选自包括以下的组:Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal、SphBl、AspA/Nalp、VacA、AIDA-1> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA> AutA> Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、Esp1、EaaA、EaaC、百日咳杆菌粘附素、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20...

【专利技术属性】
技术研发人员：约阿希姆·乔斯，鲁斯·马斯，伊娃·克拉嫩，
申请(专利权)人：齐鲁斯专利I投资有限及两合公司，
类型：
国别省市：