全细胞生物催化剂制造技术

本发明专利技术涉及一种制备腈水解酶催化反应产物的方法，包括步骤：(i)提供表面含所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制剂；和(ii)在与腈水解酶活性相容的条件下使所述微生物和/或微生物膜制剂接触一种或多种腈水解酶的底物。本发明专利技术还涉及采用展示腈水解酶的全细胞生物催化剂或其膜制剂转化外消旋扁桃腈制备光学纯(R)-扁桃酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】全细胞生物催化剂
技术实现思路
本专利技术涉及一种制备腈水解酶催化反应产物的方法，包括步骤(i)提供表面含所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制剂；和(ii)在与腈水解酶活性相容的条件下使所述微生物和/或其膜制剂接触一种或多种腈水解酶的底物。具体而言，本专利技术涉及一种制备羧酸的方法，包括步骤(i)提供表面含腈水解酶的微生物和/或其膜制剂；(ii)使该微生物和/或其膜制剂接触腈，如此腈水解酶可催化腈转变为羧酸。本专利技术还涉及采用展示腈水解酶的全细胞生物催化剂或其膜制剂处理外消旋扁桃腈制备光学纯(R)-扁桃酸的方法。腈是制备羧酸、酰胺等多种产物的重要前体分子(Banerjee等人，2002年)。然而，由于腈非常稳定，必须在强碱或强酸及高温下才能使腈发生化学转变(Banerjee等人，2002年；Nagasawa等人，1990年)。而且，提纯各自反应混合物中的这些产物非常令人厌烦。 腈水解酶(如EC 3. 5. 5. I)是能在一步反应中将腈转变为相应羧酸和氨的酶(Thimann和Mahadevan，1964年)。因为一方面，羧酸产物常用作各种化学生产过程的中间体，采用腈水解酶的工业效益具有实质性吸引力；另一方面，可利用腈水解酶给废物解毒(Banerjee等人,2002年；Thuku等人,2009年)。此外,腈水解酶的选择性高,能在温和条件下产生光学纯羧酸，而不需要常规化学过程中所需的高成本封闭和去封闭步骤和催化剂(Banerjee等人,2002年)。所述高度选择性使采用常规方法不能或很难实现的产物合成成为可能。腈水解酶与量化有关的最重要工业应用是将外消旋扁桃腈转变为光学纯(R)-扁桃酸(Rey等人，2004年)。利用(R)-扁桃酸可分离用非对映异构体盐(产生的)外消旋物中的对映体。此外，(R)-扁桃酸是化学合成新型活性制剂中的一种重要手性中间体产物。从文献中可熟知，粪产碱杆菌(A. faecalis)的腈水解酶能以高对映选择性将扁桃腈转变为扁桃酸。手性羧酸，如扁桃酸提供了有机化学所需的化合物，因为其可作为多种药物制剂或植物保护剂的基础产物。因此，例如，(R)-或(S)-扁桃酸可用于外消旋胺的外消旋体拆分。此外，可利用(R)-扁桃酸作为化学合成的中间体。然而，已特征鉴定了腈水解酶是公认的不稳定酶(Buchholz、Kasche和Bornscheuer, 2005年)，因此在工业中罕见采用其纯化酶或采用其全细胞制剂。腈水解酶的活性中心含三个氨基酸残基(催化三联体)的催化序列，其所含的保守性活性位点半胱氨酸残基(Kobayashi等人，1992年)对自身氧化敏感，易与许多化学物质如含巯基试剂反应(Kobayashi 等人，1992 年)。只要位于细胞内，腈水解酶就受到细菌细胞质氧化还原环境的保护，处于还原状态(Choi和Lee，2004年)而防止其巯基氧化。然而，已证明腈水解酶接触氧时即丧失活性，此观察归因于其活性中心氧化还原敏感三联体中的半胱氨酸的易感性(Mateo等人，2006年)。已采用了几种方法来克服腈水解酶活性和/或稳定性不足的缺点。一种方法是采用表达腈水解酶的全细胞而不是纯化的酶制剂，提供菌株特异性或重组形式的胞内腈水解酶(Kaul等人，2007年)。例如，研究人员采用了表达腈水解酶的粪产碱杆菌(Kaul, A. Banerjee和U. C. Banerjee, 2006年)作为含腈水解酶的全细胞催化齐U。对映体过量达到了 97%。此法的原理是将该酶保持在其自然环境细菌的细胞质中，通过其内源性折叠机制和连续转换及蛋白质生物合成，保持该蛋白质稳定性和活性水平的恒定。然而，这必须采用费时费力的加工过程制备全细胞催化剂，并将其附着于合适的基质系统(藻酸盐)。另外，待转换的底物需要穿越所选细菌的细胞膜和表面，进入胞质后，将遭遇一系列具有替代活性的酶和竞争性底物。最后，全细胞催化剂将会污染制备的所需产品，因此对于敏感的应用，例如制药、化妆品、卫生用品及饮料和食物制品，不能采用这种产物。另一种制备可工业应用的高水平功能性腈水解酶的方法涉及采用伴侣蛋白。GroEL家族伴侣蛋白是位于胞质中的必需蛋白质，为细胞通过多轮底物蛋白的ATP依赖性结合、包裹及释放、产生正确折叠的蛋白质所必需(Hartl, F. U.和Hayer-Hartl, M. , 2002年)。删除GroEL最终不仅导致功能性底物蛋白水平降低，而且由于大量未折叠蛋白的积聚，可导致细菌细胞死亡。已实现了伴侣蛋白，更具体说是GroEL系统的多种特异性组分与 重组的腈水解酶在大肠杆菌胞质中共表达(5，629，190号美国专利，图9)。此方法产生的可溶性蛋白质水平高于细胞的内源性伴侣蛋白水平。然而，这种方法的前提条件是采用全细胞以提供折叠机制，或增加分离纯化的伴侣蛋白及其辅因子，和增加腈水解酶制剂的底物。美国专利No. 5，629，190说明了重组表达腈水解酶的大肠杆菌全细胞的使用方法。然而，由于大肠杆菌细胞含有特定的胞内酶装置，所产生的反应很复杂，其结果无法预计，即使是重组表达的蛋白制剂，如GroEL，能否有助于微生物合成的多肽(例如重组表达的腈水解酶)折叠也无法预计。如美国专利No. 5，629，190所揭示的那样，腈水解酶催化腈转变为羧酸(的反应)与腈水合酶催化反应(导致酰胺的形成)相竞争，致使产率降低，并产生很难去除的不良副产物。细胞中还存在可能修饰腈的腈基或其他部分的其他酶。另一种方法涉及交联酶聚集体的制备和应用，即制备可溶性重组酶和采用反应活性双功能化学试剂，如戊二醛或聚(乙烯亚胺)，作后续交联。然而，Kaul等人(2007)证明，这种固定可导致显著降低反应速率和专一性常数。此外，化学交联可导致对底物的特异性改变，观察到这与产生的蛋白质分子被“锁定”于特定构象的交联过程相关。而且，不能直接分离得到所需反应产物中的各批固定酶及其降解产物和碎片。Yamamoto等人(1991年)测试了各种分离物(野生型菌株)转化扁桃腈成为(R) - (_)-扁桃酸的能力。发现粪产碱杆菌ATCC 8750菌株从外消旋扁桃腈产生(R) _ _扁桃酸的活性和对映选择性水平最高(Yamamoto等人，1991年)。具体而言，静息细胞使扁桃腈产生(R)-(-)-扁桃酸的对映体过量达100%。粪产碱杆菌ATCC 8750含有R型对映选择性腈水解酶和酰胺酶，分别用于加工扁桃腈和扁桃酰胺。由于从外消旋扁桃腈产生(R)_ _扁桃酸的广率为91 ,而未留下(S)-扁桃臆，因此反应中剩余的(S)-(-)-扁桃腈自发性外消旋，一方面是因为扁桃腈的(R)-和(S)-异构体达到了化学平衡，另一方面是因为苯甲醛/氢氰酸(HCN)的作用。因此，几乎所有的扁桃腈被消耗和转变成(R)-(-)_扁桃酸。需要注意的是，按照Yamamoto等人(1991年)所述，用于制备(R)-扁桃酸的粪产碱杆菌细胞需要专门优化的培养条件。有人克隆了细菌来源的不同腈水解酶，并在大肠杆菌中重组表达(Kiziak等人，2005年；Luo等人，2008年；Rustler等人，2008年；6，180, 359号美国专利；Ress-L6schke等人，1998年)。业已对腈水解酶进行了生化特征鉴定(Kiziak等人,2005年)。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔基姆·何塞，露丝·马斯，克里斯蒂安·德策尔，
申请(专利权)人：希鲁士股份有限公司与帕滕特有限合资公司，
类型：发明
国别省市：