四翅滨藜酮脂酰辅酶A硫解酶基因克隆及其应用属植物基因工程技术领域，一种植物抗逆相关蛋白AcKAT1由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述植物抗逆性相关蛋白AcKAT1的编码基因AcKAT1的编码序列为下列之一:1)编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的5’端第50-1084位脱氧核苷酸；2)编码序列表中SEQ ID NO:2蛋白质序列的核苷酸分子；一种重组表达载体，含有植物抗逆性相关蛋白AcKAT1的编码基因AcKAT1；一种重组菌，含有植物抗逆性相关蛋白AcKAT1的编码基因AcKAT1；在本源植物四翅滨藜中通过qRT-PCR检测，该基因在NaCl和PEG胁迫下上调表达。同时，将AcKAT1导入酿酒酵母得到转基因酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，进行胁迫处理，结果亦可表明AcKAT1可以提升酵母耐干旱(山梨醇)和耐盐(NaCl)的能力。
【技术实现步骤摘要】
四翅滨藜酮脂酰辅酶A硫解酶基因克隆及其应用
[0001 ] 本专利技术属植物基因工程
，尤其涉及使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表达与植物抗逆（具体为盐和干旱）相关的蛋白AcKATl，同时采 用实时荧光定量PCR(实时PCR，Real-Time-PCR，）的方法来研究该基因对非生物胁迫NaCl 和PEG的功能。
技术介绍
目前农业生产中逆境胁迫是影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。农作物在整 个生长季节中，会受到各种逆境因素的影响，如生物胁迫的病虫害等，及非生物胁迫的盐、 碱、高温、低温、干旱等，这些胁迫限制了植物的生长发育，最终会导致作物产量降低，品质 下降，直接影响甚至威胁到粮食安全，在这些严重影响作物生产的逆境因子中，极端温度、 干旱、高盐、营养失调（包括矿物质中毒和矿物质缺乏）是影响作物产量的主要限制因子， 每年直接从盐、碱、干旱、低温胁迫等逆境造成的农作物减产仍然超过总产量的20%，而干 旱和盐胁迫是最主要的制约因素。因此，研究与非生物胁迫有关的基因，并将其导入作物 进行分子育种，引起了科研工作者的广泛兴趣，而通过基因工程的方法进行逆境相关基因 的克隆及其功能的解析，能够为植物抗逆育种提供有价值的信息和材料。然而，从直接解决 农业生产中关键问题的角度来看，在农业生产上能起显著作用的转基因作物种类还不多， 人类对植物逆境适应性分子机理的研究还远远不够，远不能满足植物分子育种的需求，同 世界发达国家相比，我国拥有自主知识产权和具有重要利用价值的基因相对较少。同时，目 前的研究也主要集中在草本植物，而对木本植物及其耐盐和干旱的分子遗传研究也相对较 少。然而，草本和木本植物在结构、生长、发育、生理，及在应对生物和非生物胁迫等方面存 在较大的差异性。所以，从木本植物中寻找抗逆相关的基因并进行研究，能够为通过基因工 程提高作物的生物和非生物胁迫耐受性这种手段提供更多的候选基因。 四翅滨藜（Atriplex canescens [Pursh]Nute)是一种盐生灌木，在分类上为藜科， 滨藜属，普遍存在于干旱、半干旱地区，具有较强的耐干旱、抗盐碱、耐寒冷和耐重金属的特 性，尤其是耐干旱和盐的特性。四翅滨藜在每年降雨量> 180_的干旱半干旱地区，年平均 气温仅为5°C左右的低温地区，甚至在极端低温为-40°C地区以及盐碱地等恶劣环境下依 然生长良好，同时在海拔2000米左右的地区也适合生长，根据已有报道，四翅滨藜被有些 国家称为生物脱盐器，它一年时间就可以从6. 07亩的土地上吸收到1吨以上的盐分，灌 木生物量也能达到15t/hm2,枝叶中的粗蛋白含量在12%以上，高产优质、富含营养，相关科 学家们认为，四翅滨藜有及其丰富的营养价值和可观的饲料用途，因此成为了荒漠、半荒漠 干旱地区非常有价值的优良饲料灌木树种。同时，四翅滨藜还具有积累硒的能力，因此在美 国也广泛用于水土保持和路坡固定，但牧场改良仍然是其主要用途。近年来，四翅滨藜先后 在中国的新疆，甘肃，宁夏，青海和其它地方种植，通过大量研究，充分体现了四翅滨藜较强 的抗盐，碱，干旱，低温，贫瘠等优良特性，渐渐成为绿化和水土保持的优良树种。 酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系统，是二倍体，它在 蛋白翻译后加工过程中能形成二硫键，具有糖基化以及蛋白折叠等特征，使得其基因表达 模式更加接近于真核植物中的表达模式，它还具有生长快速、遗传操作简便和易于培养等 的优点，所以在对植物功能基因的相关研究中，用酵母表达系统筛选具有原核表达系统不 可替代的优势性。酿酒酵母菌株INVScl (基因型为MATa his3Dlleu2trpl-289ura3-52)是 经过人工改造后的尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株的酵母转化子运用SC-U缺培养基筛选 时，假阳性低，转化效率高，因此是理想的酵母表达菌株。利用酵母营养缺陷型菌株对植物 cDNA文库的研究和挖掘，在植物中受到越来越多关注。Frommer等和Hsu等（1993年）在筛 选拟南芥cDNA文库中克隆到氨基酸透过酶的NAT2/AAP1基因，该基因可以互补酵母的氨基 酸转运缺陷突变体；酵母系统研究植物耐盐性表达基因的功能研究也被广泛应用，Yamada 等（2002年）就利用酵母转化子来验证丙二烯环化氧化酶（AOC)基因可以大大提高抗盐 性，进一步推测到AOC基因在植物中也可能具有抗盐功能。唐玉林等（2007年）利用酵母 研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母转化子的耐盐能力得到显著提高，从而推测SALI3-2 基因所具有的抗逆能力。由此可见，利用酵母表达外源蛋白并研究其功能已经受到广泛应 用。 Real-Time PCR(RT-PCR)是一种目前应用普遍的检测基因表达的技术，它通过 添加荧光基团，并利用荧光信号累积来实时监测整个PCR的进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析，该方法能够避免传统PCR定量终产物时产生的偏差，从而使实验的 重复性得到提高，该技术现已被广泛用于监测细胞mRNA的表达量变化。SYBR green是 Real-time PCR的常用方法之一，该法灵敏度高，通用性好，方法简单等优点而被国内外科 研中普遍使用。 脂肪酸主要是通过β_氧化循环分解代谢从而为有机体提供能量，在植物中， 氧化反应只发生在过氧化物酶体上。植物过氧化物酶体中脂肪酸氧化反应的 核心步骤是脂酰CoA硫醇末端2个碳原子单元乙酰CoA的反复硫解。硫解酶在脂肪 酸生物合成与降解中起着很重要的催化作用，无论在真核生物还是在原核生物中都是 普遍存在的一类生物催化剂。硫解酶按照不同的功能和特异性底物不同，可分为两种 不同的类型：Thiolase-I (3-ketoacyl-CoAthiolase ;3_ 酮脂醜辅酶 A 硫解酶；ΚΑΤ)和 Thiolase-II (acetoacetyl-CoA thiolase ;乙醜辅酶A醜基转移酶；ACAT)。其中 β-丽醋醜 辅酶A硫解酶（3-ketoacyl CoAthiolase，KAT)也叫分解硫解酶，便在脂肪酸的分解过程中 起着重要作用，β-酮酯酰COA硫解酶催化β氧化过程中的硫解反应，作为脂肪酸β-氧化 的最后一步，该反应不仅给植物体供应大量能量，其反应的产物还可作为植物合成信号分 子，特别是信号分子茉莉酸的原料。ACAT(EC2. 3. 1.9)是在生酮过程中利用两个乙酰-CoA 合成乙酰乙酰-CoA,故该酶也被称为合成硫解酶（synthetic thiolase)，但它也能催化乙 酰乙酰-CoA的硫解。这两种类型的硫解酶之间具有很高的序列一致性，而且两种硫解酶肽 链折叠方式也是很相似，两种硫解酶均以酶活性中心的半胱氨酸为催化残基。硫解酶家族 通常有一个在C末端保守的G-motif，为CIGXGXG。作为β -氧化循环的关键酶，硫解酶在植 物体内广泛分布。迄今，已经从南瓜、拟南芥、葡萄（ΧΜ002285619. 1)、番茄（ΑΚ327019. 1)、 毛果杨（ΧΜ002299248. 1)、小麦（ΑΒ539589. 1)和黄瓜（CAA4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物抗逆相关蛋白AcKAT1，其特征在于由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
【技术特征摘要】
1. 一种植物抗逆相关蛋白AcKATl，其特征在于由序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸 序列组成的蛋白质。2. 按权利要求1所述植物抗逆性相关蛋白AcKATl的编码基因AcKATl，其特征在于所 述编码基因AcKATl的编码序列为下列之一： 1) 编码序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘洪玉，孙新华，李敬涛，余刚，刘金亮，贾承国，张祥辉，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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