源于土曲霉的活性增强的酰基转移酶突变体制造技术

本发明专利技术提供了与源自土曲霉的野生型酰基转移酶相比具有提高活性的酰基转移酶突变体。还提供了编码酰基转移酶突变体的多核苷酸、能表达所述突变体的宿主细胞及该酰基转移酶突变体的生产方法。可用于大规模合成重要的他汀类化合物辛伐他汀。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了与源自土曲霉的野生型酰基转移酶相比具有提高活性的酰基转移酶突变体。还提供了编码酰基转移酶突变体的多核苷酸、能表达所述突变体的宿主细胞及该酰基转移酶突变体的生产方法。可用于大规模合成重要的他汀类化合物辛伐他汀。【专利说明】源于土曲霉的活性增强的酰基转移酶突变体
本公开内容涉及用于生物催化生成辛伐他汀的方法和材料。更具体的，本公开内容涉及比野生型酰基转移酶相比具有改进活性的非天然存在的酰基转移酶突变体、编码所述酰基转移酶突变体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的宿主细胞、所述酰基转移酶突变体的生产方法及使用所述酰基转移酶突变体生物催化生成辛伐他汀的方法和材料。 专利技术背景辛伐他汀是Merck公司研制的降血脂药,商品名Zocor,辛伐他汀(simvastatin)是洛伐他汀的半合成衍生物，而洛伐他汀是分离自土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液的天然产物。辛伐他汀的药理作用是作为竞争性抑制剂抑制肝脏细胞内羟甲戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase)活力，限制HMG-CoA向甲基二轻戍酸的转化,从而减少内源总胆固醇的生物合成总量。与相同剂量的洛伐他汀(1vastatin)、普伐他汀(pravastatin)和氟伐他汀(fluvastatin)等其他HMG-CoA还原酶抑制剂相比,辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。 1984年，Hoffman等发表了以洛伐他汀为起始原料，化学合成辛伐他汀的侧链水解路线，但该路线的副产物较多，因而给产物分离纯化带来不利影响。 1986年,Sleiteinger等发表了洛伐他汀的直接甲基化路线，该路线经Verhoeven(1989年)、Kumar (1998年)等修改提高，成为目前生产上使用最多的工艺，但直接甲基化路线需要多种昂贵及危险的化学试剂。 由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，并因此造成目前制备辛伐他汀的成本较高。因此，极需一种能低成本高效率制备辛伐他汀和相关化合物的方法。 Xie等已从Aspergillus, terreus菌克隆获得酰基转移酶的编码基因并在E.coli中高表达。利用所得工程菌可以直接催化莫那克林J到辛伐他汀的转化，转化率达到99%。印度Ranganathan将不同来源的聚酮合成酶(PKS)功能域DNA序列组合成多种不同的洛伐他汀二酮合成酶基因，并在土曲霉(Aspergillus terreus)中表达,直接发酵产生辛伐他汀。 Xie等用丙氨酸残基或极性天然氨基酸替换Cys40和Cys60，显著提高酰基转移酶的可溶性表达。并且进一步实验证明这些突变具有可加性，其中C40A/C60N双突变体表现出溶解度和全细胞生物催化活性近50%的增长。 以上主要通过过表达酰基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌株作为全细胞生物催化剂，在单个发酵过程中合成制备量的辛伐他汀。以上研究证明酰基转移酶可用于辛伐他汀等重要的降低胆固醇药物的生物合成，是一种非常有吸引力的酶。然而，在使用分离的酰基转移酶进行的随后的实验中，稳定性和反应速率被证实是有问题的。具体来说，发现酰基转移酶在高蛋白浓度时容易沉淀，而在较低浓度时缓慢沉淀。此外，发现产物辛伐他汀会竞争酰基转移酶，显著地阻碍酰化的总净速率。 酰基转移酶在大肠杆菌中过表达时也高度倾向于错误折叠和聚集，使得对于工业规模生产来说即使是全细胞生物催化系统也不太理想。 朱丽平等在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达酰基转移酶，通过优化发酵条件，发酵培养基，接种量，诱导物浓度及诱导时间等，最后的酰基转移酶表达水平仅为100mg/L，辛伐他汀产量也仅为1.2g/L，远远达不到工业规模生产的要求。
技术实现思路
土曲霉(Aspergillus terreus)的LovD基因编码酰基转移酶,该酰基转移酶能够使天然产物洛伐他汀的水解产物莫纳可林J(Monacolin J)转化为辛伐他汀。本公开内容的专利技术人已发现包括在一定位置突变的酰基转移酶与土曲霉(Aspergillus terreus)产生的野生型酰基转移酶(SEQ ID N0:2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酰基转移酶”、“野生型LovD酶”及“野生型LovD酰基转移酶”指由源自土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型酰基转移酶基因SEQ ID NO:1编码的，并具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酰基转移酶。该酶可以使用硫酯以区域专一的方式酰化的CS羟基基团以产生辛伐他汀。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指如在体外或体内试验中所测量的与野生型酰基转移酶相比，表现出使底物(例如莫纳可林J或其盐)向产物(例如辛伐他汀或其盐)转化率增加的酰基转移酶。 本专利技术提供了与野生型酰基转移酶相比具有提高活性的酰基转移酶突变体。还提供了编码酰基转移酶突变体的多核苷酸、能表达所述突变体的宿主细胞及该酰基转移酶突变体的生产方法。可用于大规模合成重要的他汀类化合物辛伐他汀。 本专利技术提供的源于土曲霉的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体，其特征在于，其是可用于辛伐他汀的发酵生产的酰基转移酶突变体，其中，突变是在亲本酰基转移酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失I个或多个氨基酸，或者在亲本酰基转移酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除I个或多个氨基酸，且与使用亲本酰基转移酶相比，其酰基转移酶活性增强2-50倍。 进一步地，所述突变体具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示:字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸:R28H，D96K，L174H, A178V, N191M, A261W, H404R。 所述的源于土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体，能够使天然产物洛伐他汀的水解产物莫纳可林J(Monacolin J)转化为辛伐他汀。所述酰基转移酶突变体，与SEQ ID N0.2的野生型酰基转移酶相比表现出更强的催化活性。酰基转移酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。 进一步地，本专利技术提供一种源于土曲霉的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体，包含SEQ ID N0.4的氨基酸序列。 全长突变的酰基转移酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酰基转移酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，I至20个氨基酸可以被删去。在另外的实施方案中，酰基转移酶突变体包括如下截短的蛋白质:其中从N-末端可以删去从I到20个氨基酸而从C-末端可以删去从I至20个氨基酸。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外本文档来自技高网...

【技术保护点】
源于土曲霉(Aspergillus terreus)的活性增强的酰基转移酶突变体，其特征在于，其是可用于辛伐他汀的发酵生产的酰基转移酶突变体，其中，突变是在亲本酰基转移酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在亲本酰基转移酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，且与使用亲本酰基转移酶相比，其酰基转移酶活性增强2‑50倍。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32