本发明专利技术涉及一种分离的二酰甘油酰基转移酶基因及其表达载体，该基因可用于提高植物种子含油量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及转移酶基因、含有该基因的酵母表达载体和植物表达载体，以及这些表达载体的转化体。本专利技术还涉及上述基因在植物性状改良上的应用。
技术介绍
传统化石能源紧缺，将使生物柴油和燃料乙醇逐步替代石油，发展成为新的基础产业和新的能源产业，以满足人类在后石油时代对液体能源的大量需求。生物柴油是指以 油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料，与传统的柴油相比，具有能量密度高、润滑性能好、储运安全、抗爆性好、燃烧充分等优良性能，是最具发展潜力的大宗生物基液体燃料。植物油含有丰富的还原态碳链，是同体积淀粉所含能量的8倍多。植物油不仅是人类营养需求的重要食用油，而且已经成为许多化工产品的重要环保原料，广泛应用于肥皂、清洁剂、润滑剂以及油漆等的生产。更重要的是植物脂肪酸还可作为生物柴油的原料。因此，利用基因工程技术，提高植物或油料作物中油脂含量，不仅对于应对日益严峻的能源形势，舒缓能源消费结构矛盾；同时，对于改善人类使用油的质量，调整农业产业结构和增加农民收入，都具有重大的意义。植物种子中的贮藏物质主要有淀粉、蛋白质和脂类。植物种子中储存的脂肪酸常以三酰甘油酯(TAGs)，即在甘油骨架上附连三个脂肪酸的形式存在。而脂肪酸成分主要是16至18碳或含一至三个双键的脂肪酸，如硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等。脂肪酸代谢主要是在质体和内质网中进行的，首先，合成脂肪酸的碳源主要是蔗糖，在种子中通过糖酵解途径将其转变成己糖，并氧化成乙酰CoA(乙酰辅酶A)。而TAG合成的骨架成分甘油3-磷酸也是通过糖酵解的中间产物合成的。随后，在质体中经乙酰CoA羧化酶(ACC)将乙酰CoA合成为丙二酰单酰CoA。然后脂肪酸合成酶复合物(FAS)以丙二酸单酰CoA为底物进行连续的聚合反应，经过数次循环聚合反应后，脂肪酸的合成可在酰基-ACP硫酯酶或酰基转移酶的作用下终止。而终止聚合后的不同碳链长度的酰基ACP，在酰基CoA合成酶的作用下合成酰基CoA，并从质体转运到内质网或胞质中。最后利用贮存在胞质中的酰基CoA池，在内质网上通过三种不同的酰基转移酶，即甘油3-磷酸酰基转移酶(G3P-AT)、溶磷脂酸酰基转移酶(LPA-AT)和二酸甘油酸基转移酶(acyl CoA diacylglycerol acy I transferase,DGAT),分别在甘油上连接脂肪酸以合成三酰甘油酯和结构磷脂(Cahoon等，Curr OpinPlant Biol. 2007，10 :236_44)。目前的研究证明，要提高种子中的油脂含量，不仅需要增加游离酰基CoA的含量，更重要的是需要增加贮藏型的三酰甘油酯(TAGs)在种子中的含量。前人的研究(Shockey等，Plant Cell 2006，18 =2294-2313 ;Kroon 等，Phytochemistry2006,67 :1166_1176)发现，在发育的种子中，DGAT催化酰基CoA和二酰甘油酯合成TGA的最后一步，虽然对于多种酰基转移酶之间的相互作用不清楚，但DGAT在油脂的合成中为关键限速步骤，直接影响种子中TAG的含量和成分已经明确。已经从蓖麻、拟南芥和花生等植物中克隆了编码DGAT的基因，包括 DGATl 和 DGAT2 以及可溶性的 DGAT3。Jako 等(Plant Physiol 2001，126 861-874)在拟南芥种子中特异超表达DGAT基因，不仅增加了种子重量，而且增加了种子含油量，表明在植物种子特异表达DGAT基因是能够提高油脂含量的。但是，并不是所有在植物中表达的DGAT基因都能提高油脂含量(Oakes等，PlantPhysiology 2011，155 :1146-1157)，这主要取决于DGAT基因的来源与类型。我们从微生物中克隆了几种不同的DGAT基因，来源酵母中克隆脂肪酸合成相关的DGAT基因，并将其导入酿酒酵母和烟草中，在种子中特异超表达以增加种子贮藏TGA的合成，最终达到提高植物种子种含油量的目的，从而在农业生产中创造更大的经济效益和社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分离的二酰甘油酰基转移酶基因，其具有SEQID NO. I所示的核苷酸序列(1563bp，其中第1561-1563位bp为终止密码子)，将所述二酰甘油酰基转移酶基因构建成表达载体，应用于植物的性状改良中，能有效地提高植物种子的油脂含量。本专利技术的所述的分离的二酰甘油酰基转移酶基因编码具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列(520aa)。本专利技术的另一个目的在于提供一种含有权利要求I所述基因的表达载体，所述表达载体选自酵母表达载体或植物表达载体中的一种。具体地，所述表达载体为具有图2所示结构的酵母表达载体，或具有图6所示结构的植物表达载体。本专利技术的另一个目的在于提供一种包含权利要求I所述基因的转化体。本专利技术的另一个目的在于提供一种含有权利要求I所述基因的转基因植物的制备方法，包括以下步骤I)将权利要求I所述基因可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体；2)用步骤I获得的植物表达载体转化宿主，获得转化体；3)将步骤2获得的转体转化植物，获得转基因植物。本专利技术还提供了提高植物种子含油量的方法，所述方法通过在植物种子中特异表达一种具有SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的二酰甘油酰基转移酶基因，以增加植物种子中TAG的量，最终达到提高植物种子含油量的目的。本专利技术也提供二酰甘油酰基转移酶基因在植物性状改良上的应用。试验结果证明，将解脂酵母二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)在酵母中表达后，酵母油脂含量比野生型酵母增加了 2. 5倍。同时，在烟草的种子中特异表达该二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)后，转基因烟草种子的含油量最高可提高25%。本专利技术方法简便易行，效果显著，不仅能提高油料作物的食用价值，而且能为生物能源提供原料，产生巨大的经济效益。 附图说明图I :解脂酵母二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)酵母表达载体的构建流程图。其中，pUCm-T为上海生工生物技术公司产品，pENTR和pYES-DEST52为Invitrogen公司产品。图2 :解脂酵母二酰甘油酰基转移酶基因(YlDGAT)酿酒酵母表达载体的结构图。其中，Ampicillin，氨苄青霉素抗性基因；pUC ori，在大肠杆菌中高拷贝复制位点；2 μ origin,在酵母中高拷贝复制位点；V5 epitope, V5抗体检测位点；6x His,多聚组氨酸位点；CYCl TT，CYC1终止子；P GALl，GALl诱导型启动子；f I origin，单链DNA复制位点；URA3，乳清酸脱羧酶基因。图3 :黄曲霉二酰甘油酰基转移酶基因(AflDGAT)酵母表达载体的构建流程图。其中，pUCm-T为上海生工生物技术公司产品，pENTR和pYES-DEST52为Invitrogen公司产品。图4 :烟曲霉二酰甘油酰基转移酶基因(AfuDGAT)酵母表达载体的构建流程图。pUCm-T为上海生工生物技术公司产品，pENTR和pYES_DEST52为Invitrogen公司女口广叩ο图5 :解脂酵母二酰本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯磊，裴炎，梁爱敏，周庆璋，张丹丹，李先碧，宋水清，李德谋，张瑞芝，肖月华，罗明，金丹，罗小英，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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