反馈抗性α-异丙基苹果酸合酶制造技术

本发明专利技术涉及一种分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％相同，其中SEQ ID NO:2在553位或在该氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸，本发明专利技术涉及一种包含所述核苷酸序列的微生物，也涉及使用这种微生物生产精细化学品的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】反馈抗性α-异丙基苹果酸合酶本专利技术涉及一种分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％相同，其中SEQIDNO:2在553位或在所述氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸(proteinogenicaminoacid)，本专利技术涉及一种包含所述核苷酸序列的微生物，也涉及使用这种微生物生产精细化学品的方法。精细化学品，其尤其包括氨基酸、有机酸、维生素、核苷和核苷酸，用于人类医学、制药产业、化妆品、食品产业和动物饲料。大量这些化合物是通过棒状细菌菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)发酵产生的。由于其非常重要，改进该产生方法的工作一直在进行。方法改进可以涉及发酵措施，例如，搅动和供给氧气，或者营养培养基的组成，例如，发酵期间的糖浓度，或者通过譬如离子交换层析给出产品形式的步骤，或者微生物本身的内在性能。诱变、筛选和突变选择的方法被用来改进所述微生物的性能。用这种方式，获得的菌株耐抗代谢物，例如亮氨酸类似物4-氮亮氨酸或5,5,5-三氟亮氨酸，并产生化合物，例如L-氨基酸，如L亮氨酸。举例来说，可提及参考文献Casaloneetal.(ResearchinMicrobiology148:613-6231997)。若干年来，重组DNA技术的方法已用于L-氨基酸-生产菌株谷氨酸棒杆菌的改进，其中，例如增强或减弱单个氨基酸生物合成基因，并研究对化合物产生的影响。可在“HandbookofCorynebacteriumglutamicum”(Eds.:L.EggelingandM.Bott,CRCPress,Taylor&Francis,2005)、JournalofBiothechnology(主编：A.Pühler)特刊，标题为“ANewErainCorynebacteriumglutamicumBiotechnology”(JournalofBiotechnology104/1-3,(2003))、和T.Scheper(总编辑)的书“MicrobialProductionofLAminoAcids”(AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology79,SpringerVerlag,Berlin,Germany,2003)中找到谷氨酸棒杆菌生物学、遗传学和生物技术的综述。在Ikeda和Nakagawa(AppliedMicrobiologyandBiotechnology62,99-109(2003))、EP1108790和Kalinowski等(JournalofBiotechnology104/1-3,(2003))中描述了谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列。在国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)(Bethesda,Maryland,USA)、日本DNA数据库(DDBJ,Mishima,Japan)或者欧洲分子生物学实验室的核苷酸序列数据库(EMBL,Heidelberg,GermanyorCambridge,UK)中也有谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列。尤其通过如下细节描述来自谷氨酸棒杆菌的编码α-异丙基苹果酸合酶的leuA基因：α-异丙基苹果酸合酶(IPMS,EC＝2.3.3.13)催化乙酰-CoA的乙酰基与3-甲基-2-氧代丁酸盐(酯)(2-氧代异戊酸盐(酯)，酮基异戊酸盐(酯))的缩合，用于3-羧基-3-羟基-4-甲基戊酸盐(酯)(2-异丙基苹果酸盐(酯))的形成。leuA基因包含1851碱基对(bp)，并编码分子量为68187的多肽。对于催化生物合成路径第一步的酶很普遍，α-异丙基苹果酸合酶受终产物亮氨酸的反馈调节(Patèketal.,AppliedEnvironmentalMicrobiology60:133-140(1994))。并且，在二价阳离子尤其是锌离子存在的情况下，该酶受辅酶A的抑制(Ulmetal.,JournalofBacteriology110(3):1118–1126(1972)；TracyandKohlhaw,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica72(5):1802–1806(1975))。根据NCBI数据库的详情，编码来自谷氨酸棒杆菌的α异丙基苹果酸合酶的leuA基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，由其编码产生的α-异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。在SEQIDNO:3中位于上游和下游的核苷酸序列另有报道。本专利技术的目的是提供一种用于产生酮异己酸或L-亮氨酸的发酵方法，所述方法具有提高的产量或者在细胞内和/或培养基中有更高的产物终浓度。本专利技术的另一目的是提供一种以这样的方式被修饰的细胞，即使存在高的细胞内浓度的亮氨酸，也能够产生酮异己酸或亮氨酸。本专利技术的另一目的是基于用于发酵的碳底物量提高酮异己酸或亮氨酸的产量。本专利技术的专利技术者令人惊讶地证实α-异丙基苹果酸合酶的一个突变引起酮异己酸和亮氨酸产生的提高。不希望被任何理论束缚，本专利技术人推测这个突变降低或者甚至消除了所述酶的反馈抑制，即通过产物结合至所述酶介导的酶活性的下降。表述“亮氨酸”与“L-亮氨酸”同义使用，也包括它的盐，例如L-亮氨酸盐酸盐，L-亮氨酸硫酸盐或者钙盐。类似地，表述酮异己酸(KIC)也包括它的盐，例如钙-KIC、钾-KIC或钠-KIC。本专利技术涉及一种分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％地相同，其中SEQIDNO:2在553位或在该氨基酸序列的相应位置具有除L-酪氨酸以外的蛋白原氨基酸。在一个优选实施方案中，由本专利技术的核苷酸序列编码的氨基酸序列在553位或者相应位置具有选自谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺的氨基酸，特别优选选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸。在一个优选实施方案中，由本专利技术的核酸序列编码的氨基酸序列在553位或相应位置具有L-天冬氨酸。在一个优选实施方案中，本专利技术的核酸序列是在1657位或相应位置具有鸟嘌呤的核酸序列，如SEQIDNO:5所示。表述“相应于所述氨基酸序列的553位的位置”或者“氨基酸序列的553位的同等位置”是指，通过在编码的多肽的N-末端区域(基于SEQIDNO:2的553位)插入或缺失一个编码氨基酸的密码子，在插入的情况下位置表述和长度表述形式上增加一个单位，或者，在缺失的情况下，减少一个单位。同样地，通过在编码的多肽的C-末端区域(基于553位)插入或缺失一个编码氨基酸的密码子，在插入的情况下长度表述形式上增加一个单位，或者，在缺失的情况下，减少一个单位。这种同等位置可以通过以“比对本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％、优选≥97％、特别优选≥98％、非常特别地优选≥99％、极其优选100％相同，其中SEQ ID NO:2在553位或在所述氨基酸序列的相应位置具有除L‑酪氨酸以外的蛋白原氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.27 DE 102012207097.41.分离的核苷酸序列，其编码一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸至少≥99％相同，其中SEQIDNO:2的553位或所述氨基酸序列的相应位置是L-天冬氨酸，并且其中所述核苷酸序列是编码分离自谷氨酸棒杆菌微生物的异丙基苹果酸合酶的可复制核苷酸序列，其中由其编码的蛋白质序列在相应于SEQIDNO:2的553位的位置是L-天冬氨酸。2.分离的核苷酸序列，其编码一种根据SEQIDNO:2的氨基酸序列，其中SEQIDNO:2的553位是L-天冬氨酸。3.权利要求1或2的核苷酸序列，其在1657位或相应位置是鸟嘌呤。4.权利要求1或2的核苷酸序列，其如SEQIDNO:5所示。5.载体，其包含权利要求1-4任一项的核苷酸序列。6.载体，其包含权利要求1-4任一项的核苷酸序列，其适合于在棒状杆菌属的微生物中复制。7.多肽，其包含权利要求1-4任一项的核苷酸序列编码的氨基酸序列。8.棒状杆菌属微生物，其包含权利要求1-4任一项的核苷酸序列或权利要求7的多肽或权利要求5或6的载体。9.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·格斯特迈尔，I·维格拉贝，
申请(专利权)人：赢创工业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE