本发明专利技术涉及酶催化技术领域，尤其是一种耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体及应用，该NADH焦磷酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。使用时，取NADH干粉，加入MgCl2、MnCl2和Tris
【技术实现步骤摘要】
一种耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体及应用
[0001]本专利技术涉及酶催化
，具体领域为一种耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体及应用。
技术介绍
[0002]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)对生物体至关重要，因为它参与数百种生物反应并调节关键的生物过程，如代谢和DNA修复。研究表明，通过基因操作上调NAD生物合成可提高酵母和果蝇的抗逆性并延长其寿命；增加NAD水平被证明可以延缓小鼠的孕激素和其他退行性疾病。而且，有充分证据表明，烟酰胺核糖(NR)和烟酰胺单核苷酸(NMN)是有效的NAD增强剂，因为它们增加了细胞NAD水平，并赋予多种健康益处；补充NR或NMN可以保护小鼠免受与年龄相关的健康恶化。
[0003]目前，这些研究主要集中在氧化形式的NAD前体，因为大多数消耗NAD的酶使用NAD作为底物。关于还原形式的NAD前体的作用知之甚少。近期有研究表明，还原形式的NR(表示为NRH)在细胞和组织中比NR或NMN可以更好地增强NAD。NRH增加了对基因毒素引起的细胞死亡的抵抗力，并且NRH向NMNH的转化独立于Nrk1或Nrk2。NRH通过腺苷激酶转化为NMNH以合成NAD，并证明口服NRH可以预防小鼠急性肾损伤。
[0004]清华大学开发了一种化学还原方法来合成还原的NMN，称为NMNH，并研究了NMNH对细胞过程的生物学影响，发现NMNH在体外和体内都是比NMN更好的NAD增强剂，并且发现NMNH增加了细胞NADH水平，诱导了还原应激，并抑制了细胞生长、糖酵解和TCA循环。
[0005]还原型烟酰胺单核苷酸(NMNH)虽然吸收效果优于NMN，但其水溶液稳定性很差，在常温中性pH时极易降解，并随时间的延长进一步加剧，对规模生产造成较大的障碍。为解决此问题，有两种方案值得尝试：一个是提升酶活、缩短总反应时间，以减少NMNH的降解发生时间，反应结束尽快进行提取流程；另一个是提升总反应体系的pH值，使NMNH的稳定性增强，减缓在反应过程中降解程度。而第一种方案可以通过筛选高酶活突变体、提升酶的耐热性而实现，由于高温下酶分子的碰撞频率加大，在一定程度上可以加快酶促反应过程，故筛选耐热性增强的酶突变体具有很高的实用意义。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体及应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]本专利技术的耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体可用于催化NADH，其使用方法为：取NADH干粉，加入MgCl2、MnCl2和Tris
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HCl，加入NADH焦磷酸酶突变体的粗酶液，30～60℃反应。
[0010]其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
[0011](1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行
组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
[0012](2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
[0013]①
摇瓶发酵
[0014]挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；
[0015]次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5
‑
6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
[0016]培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，
‑
70℃保存；同时取少量菌体进行SDS
‑
PAGE检测；
[0017]②
分批补料发酵
[0018]分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为OD2.0时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为50.0时，控制温度为25℃，并用0.1mM IPTG诱导表达16小时，离心收菌体
‑
25℃保存，使用时按每公斤湿菌体加入2公斤纯水使用。
[0019]其中，所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
[0020]其中，所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。
[0021]其中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体能够高温催化NADH，与野生型NADH焦磷酸酶相比，表现出更强的热稳定性，可取得较好的社会效益和经济价值。
附图说明
[0024]图1为0.5g/L NADH高效液相色谱结果；19.2分钟为底物NADH。
[0025]图2为0.4g/L NMNH高效液相色谱结果；8.2分钟为产物NMNH峰。
[0026]图3为实施例5反应15分钟的检测结果。
[0027]图4为对比例1反应15分钟的检测结果。
[0028]图5为实施例6反应23小时的检测结果。
[0029]图6为实施例7反应15分钟的检测结果。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。
[0032]以下实施例中涉及到的液相检测条件如下：
[0033]流动相：A相：15.6g二水合本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.权利要求1所述耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体在催化NADH中的应用。3.根据权利要求2所述耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体在催化NADH中的应用，其特征在于：取NADH干粉，加入MgCl2、MnCl2和Tris
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HCl，加入NADH焦磷酸酶突变体的粗酶液，30～60℃反应。4.根据权利要求3所述耐热性增强的NADH焦磷酸酶突变体在催化NADH中的应用，其特征在于，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
①
摇瓶发酵挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L；次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5
‑
6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，钱明，靳思雨，高顾杰，彭朋，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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