经修饰的酶制造技术

本发明专利技术涉及修饰的Dda解旋酶，其可用于控制多核苷酸的移动，并且特别有助于对多核苷酸进行测序。进行测序。

【技术实现步骤摘要】
经修饰的酶
[0001]本申请是申请日为2015年10月06日，申请号为201580066254.6，专利技术名称为“经修饰的酶”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种修饰的Dda解旋酶，其可用于控制多核苷酸的移动，并且特别有助于测序多核苷酸。

技术介绍

[0003]目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。
[0004]跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔得到了许多关注。
[0005]当跨纳米孔施加电势时，在，当分析物如核苷酸在桶(barrel)中短暂停留一段时间时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用多核苷酸结合蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。

技术实现思路

[0006]令人出乎意料的是，专利技术人已经鉴定出特异性Dda突变体，该突变体具有提升的能力以控制多核苷酸穿过孔的移动。本专利技术的突变体显示减少的向前滑移(slipping)。这是DNA通过至少4个连续核苷酸并且通常通过超过10个连续核苷酸相对孔向前移动的现象。向前滑移可能涉及100个或更多个连续的核苷酸的向前移动，这对于每个多核苷酸可能发生多次。对于多核苷酸测序，向前滑移可能是有问题的。由专利技术人鉴定的突变体通常包含突变的组合，即(1)与单链DNA(ssDNA)中的核苷酸相互作用的氨基酸的一个或多个取代，和(2)与跨膜孔相互作用的突变体的一部分上的一个或多个修饰。
[0007]因此，本专利技术提供了一种DNA依赖性ATPase(Dda)解旋酶，在其中(a)与单链DNA(ssDNA)中的一个或多个核苷酸相互作用的至少一个氨基酸被取代，和(b)与跨膜孔相互作用的解旋酶的一部分包括一个或多个修饰，其中，所述解旋酶具有控制多核苷酸的移动的能力。
[0008]本专利技术还提供：
[0009]一种构建体，其包含本专利技术所述的解旋酶和附加的多核苷酸结合部分，其中，所述解旋酶与所述多核苷酸结合部分连接，并且所述构建体具有控制多核苷酸的移动的能力；
[0010]一种多核苷酸，其包含对本专利技术所述的解旋酶或本专利技术所述的构建体进行编码的序列；
[0011]一种载体，其包含与启动子可操作地连接的本专利技术所述的多核苷酸；
[0012]一种宿主细胞，其包含本专利技术所述的载体；
[0013]一种制备本专利技术所述的解旋酶或本专利技术所述的构建体的方法，其包括对本专利技术所述的多核苷酸进行表达，用本专利技术所述的载体对细胞进行转染或对本专利技术所述的宿主细胞进行培养；
[0014]一种控制多核苷酸的移动的方法，包括使所述多核苷酸与本专利技术所述的解旋酶或本专利技术所述的构建体接触，从而控制多核苷酸的移动；
[0015]一种表征目标多核苷酸的方法，包括：(a)使所述目标多核苷酸与跨膜孔和本专利技术所述的解旋酶或本专利技术所述的构建体接触，使得所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动；以及(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸；
[0016]一种用于形成表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括：在(a)孔和(b)本专利技术所述的解旋酶或本专利技术所述的构建体之间形成复合物，从而形成用于表征目标多核苷酸的传感器；
[0017]一种用于表征目标多核苷酸的传感器，其包含在(a)孔和(b)本专利技术所述的解旋酶或本专利技术所述的构建体之间的复合物；
[0018]本专利技术所述的解旋酶或本专利技术所述的构建体的用途，为控制目标多核苷酸穿过孔的移动。
[0019]一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，其包含(a)孔和(b)本专利技术所述的解旋酶或本专利技术所述的构建体；
[0020]一种用于表征样品中目标多核苷酸的装置，包括(a)多个孔和(b)多个本专利技术所述的解旋酶或多个本专利技术所述的构建体；和
[0021]一系列与多核苷酸连接的两个或多个解旋酶，其中，两个或多个解旋酶中的至少一个是本专利技术所述的解旋酶。
附图说明
[0022]图1示出了T4 Dda
‑
E94C/A360C/C109A/C136A(具有E94C/A360C/C109A/C136A突变的SEQ ID NO:8)相对于MspA
‑
(G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D118R/Q126R/D134R/E139K)8(具有G75S/G77S/L88N/D90N/D91N/D118R/Q126R/D134R/E139K突变的SEQ ID NO:2＝MspA突变体1)或MspA
‑
((缺失
‑
L74/G75/D118/L119)D56N/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K)8(具有D56N/E59R/L88N/D90N/D91N/Q126R/D134R/E139K突变并缺失L74/G75/D118/L119氨基酸的SEQ ID NO:2＝MspA突变体2)的三种不同的初始模拟取向。运行1和运行2之间的区别在于尽管孔和酶处于相同位点，酶和孔均具有不同的侧链构象。在运行3中，酶相对于纳米孔略微倾斜。
[0023]图2示出了纳米孔MspA突变体1与酶突变体1的相互作用点的图表(y轴标签＝孔/酶接触的数量，x轴标签＝孔氨基酸残基数量)。图表的每一行示出了不同酶/纳米孔取向例如，运行1
‑
3的相互作用点。
[0024]图3示出了酶突变体1与MspA突变体1的相互作用点的图表(y轴标签＝孔/酶接触的数量，x轴标签＝酶氨基酸残基数量)。图表的每一行示出了不同酶/纳米孔取向例如，运行1
‑
3的相互作用点。
[0025]图4示出了纳米孔MspA突变体2与酶突变体1的相互作用点的图表(y轴标签＝孔/酶接触的数量，x轴标签＝孔氨基酸残基数量)。图表的每一行示出了不同酶/纳米孔取向例如，运行1
‑
3的相互作用点。
[0026]图5示出了酶突变体1与MspA突变体2的相互作用点的图表(y轴标签＝孔/酶接触点数量，x轴标签＝酶氨基酸残基数量)。图表的每一行示出了不同酶/纳米孔取向例如，运行1
‑
3的相互作用点。
[0027]图6(A)示出了图表(y轴标签＝孔氨基酸残基数量，x轴标签＝酶氨基酸残基数量)的两个区域，其示出了来自运行1的孔(MspA突变体2)中的哪些氨基酸与酶(酶突变体1)中的特定氨基酸相互作用。图6(B)示出了图表(y轴标签(a1)＝孔氨基酸残基数量，y轴标签(a2)＝孔/酶接触的数量，x轴标签＝酶氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA依赖性ATPase(Dda)解旋酶，其是与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少75％的同一性的变体，其中：(a)F98被包含较大侧链(R基团)的氨基酸取代，其中，所述较大侧链(R基团)包括增加数目的碳原子，具有增加的长度，增加的分子体积和/或具有增加的范德华体积。(b)与跨膜孔相互作用的解旋酶的一部分包括一个或多个修饰，与跨膜孔相互作用的所述解旋酶的一部分包括SEQ ID NO:8中的位点1,2,3,4,5,6,51,176,177,178,179,180,181,185,189,191,193,194,195,197,198,199,200,201,202,203,204,207,208,209,210,211,212,213,216,219,220,221,223,224,226,227,228,229,247,254,255,256,257,258,259,260,261,298,300,304,308,318,319,321,337,347,350,351,405,415,422,434,437,438；其中，所述解旋酶具有控制多核苷酸移动的能力。2.根据权利要求1所述的DNA依赖性ATPase(Dda)解旋酶，其中，H82,N88,P89,D121,V150,P152,F240,F276,S287,H396和Y415中的至少一个被取代，和/或H64,T80,S83,N242,K243,N293,T394和K397中的至少一个被取代。3.根据权利要求1或2所述的解旋酶，其中，在(a)中，H82,N88,P89,D121,V150,P152,F240,F276,S287,H396和Y415中的至少一个被包含较大侧链(R基团)的氨基酸取代，所述较大侧链(R基团)包括增加数目的碳原子，具有增加的长度，具有增加的分子体积和/或具有增加的范德华体积，可选地，所述较大侧链(R基团)增加了所述至少一个氨基酸与ssDNA中一个或多个核苷酸之间的(i)静电相互作用；(ii)氢键和/或(iii)阳离子
‑
pi(阳离子
‑
π)相互作用。4.根据前述权利要求中任一项所述的解旋酶，其中，H82,N88,P89,D121,V150,P152,F240,F276,S287,H396和Y415中的至少一个被取代，其中，组氨酸(H)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)或天冬酰胺(N)或(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代；天冬酰胺(N)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)或组氨酸(H)或(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代；脯氨酸(P)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)或组氨酸(H)；(iii)酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)或(iv)亮氨酸(L)、缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)取代；苯丙氨酸(F)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)组氨酸(H)或(iii)酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代；天冬氨酸(D)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)或组氨酸(H)或(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代；缬氨酸(V)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)或组氨酸(H)；(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)或(iv)异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)取代；丝氨酸(S)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)；(ii)谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)或组氨酸(H)；(iii)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)或(iv)异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)取代；和/或酪氨酸(Y)被(i)精氨酸(R)或赖氨酸(K)或(iii)色氨酸(W)取代。
5.根据前述权利要求中任一项所述的解旋酶，其中，所述解旋酶是SEQ ID NO:8的变体，并且包含：
‑
H82N；
‑
H82Q；
‑
N88Y；
‑
P89T；
‑
H82W；
‑
P89L；
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P89F；
‑
N88R；
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P89V；
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D121H；
‑
N88H；
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P89I；
‑
D121Y；
‑
N88W；
‑
P89E；
‑
D121K；
‑
V150I；
‑
H396Q；
‑
F98W/P152F；
‑
V150L；
‑
H396K；
‑
F98W/P152Y；
‑
V150N；
‑
Y415W；
‑
F98W/P152H；
‑
V150W；
‑
Y415R；
‑
F98W/P152I；
‑
V150H；
‑
F98W/H82N；
‑
F98W/P152L；
‑
P152W；
‑
F98W/H82Q；
‑
F98W/P152V；
‑
P152F；
‑
F98W/H82W；
‑
F98W/F240W；
‑
P152Y；
‑
F98W/N88R；
‑
F98W/F240Y；
‑
P152H；
‑
F98W/N88H；
‑
F98W/F240H；
‑
P152I；
‑
F98W/N88W；
‑
F98W/F276W；
‑
P152L；
‑
F98W/N88Y；
‑
F98W/F276R；
‑
P152V；
‑
F98W/P89L；
‑
F98W/F276K；
‑
F240W；
‑
F98W/P89V；
‑
F98W/F276H；
‑
F240Y；
‑
F98W/P89I；
‑
F98W/S287K；
‑
F240H；
‑
F98W/P89T；
‑
F98W/S287R；
‑
F276W；
‑
F98W/P89F；
‑
F98W/S287W；
‑
F276R；
‑
F98W/D121H；
‑
F98W/S287F；
‑
F276K；
‑
F98W/D121Y；
‑
F98W/H396Y；
‑
F276H；
‑
F98W/D121K；
‑
F98W/H396F；
‑
S287K；
‑
F98W/V150I；
‑
F98W/H396Q；
‑
S287R；
‑
F98W/V150L；
‑
F98W/Y415W；
‑
S287W；
‑
F98W/V150N；或者
‑
S287F；
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F98W/V150W；
‑
F98W/Y415R。
‑
H396Y；
‑
F98W/V150H；
‑
H396F；
‑
F98W/P152W。6.根据前述权利要求中任一项所述的解旋酶，其中，H64,T80,S83,N242,K243,N293,T394和K397中的至少一个被取代，所述H64,T80,S83,N242,K243,N293,T394和K397中的至少一个被取代增加了所述至少一个氨基酸和所述ssDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁，
申请(专利权)人：牛津纳米孔科技公开有限公司，
类型：发明
国别省市：