【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的表征目标多核苷酸的方法。所述方法使用孔和dna依赖性atp酶(dda)解旋酶。所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。本专利技术还涉及一种修饰的dda解旋酶，其可以用于控制所述多核苷酸的移动并特别有利于测序多核苷酸。
技术介绍
1、目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如dna或rna)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术以产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。
2、跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的dna测序技术的纳米孔受到了许多关注。
3、当跨纳米孔施加电势时，当分析物如核苷酸短暂地停留在桶(barrel)中一定时间段时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知信号和持续时间的电流变化。在“链测序”方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并能实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用核苷酸处理蛋白，诸如解旋酶，以控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。
技术实现思路
1、本专利技术人已经证明了dda解旋酶能控制多核苷酸穿过孔的移动，尤其当施加电势如电压时。所述解旋酶能以可控的且逐步的方式逆着或顺着由所施加电压产生的场的方向移动目标多核苷酸。
2、本专利技术人还出乎意料地鉴定了具有提高的控制多核苷酸穿过孔的移动的能力的特定dda突变体。该突变体通常包括位于(i)塔结构域和/或(
3、相应地，本专利技术提供了一种dda解旋酶，其中在(i)塔结构域和/或(ii)销结构域和/或(iii)1a(reca型马达)结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸，其中所述解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。
4、本专利技术还提供了:
5、-一种dda解旋酶，在所述解旋酶中，在钩结构域和/或2a(reca型马达)结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸，其中所述解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力；
6、-一种dda解旋酶，其被修饰以减少其表面负电荷，其中所述解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力；
7、-第一多肽，包括来自dda解旋酶的销结构域和1a(reca型马达)结构域，不包括来自所述dda解旋酶的任何其它结构域，其中所述销结构域和/或1a(reca型马达)结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸；
8、-第二多肽，包括来自dda解旋酶的2a(reca型马达)结构域、塔结构域和钩结构域，不包括来自所述dda解旋酶的任何其它结构域，其中所述塔结构域中引入了至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸；
9、-一种解旋酶，包括共价连接到本专利技术的第二多肽的本专利技术的第一多肽，其中所述解旋酶具有控制多核苷酸移动的能力；
10、-一种构建体，包括本专利技术的dda解旋酶或解旋酶以及额外的多核苷酸结合部分，其中所述解旋酶连接到所述多核苷酸结合部分并且所述构建体具有控制多核苷酸移动的能力；
11、-一种多核苷酸，包括编码本专利技术的解旋酶、本专利技术的多肽或本专利技术的构建体的序列；
12、-一种载体，包括可操作性连接到启动子的本专利技术的多核苷酸；
13、-一种宿主细胞，包括本专利技术的载体；
14、-一种制备本专利技术的解旋酶、本专利技术的多肽或本专利技术的构建体的方法，其包括表达专利技术的多核苷酸、用本专利技术的载体转染细胞或培养本专利技术的宿主细胞；一种控制多核苷酸移动的方法，包括将所述多核苷酸与本专利技术的dda解旋酶或构建体接触并由此控制多核苷酸的移动；
15、-一种表征目标多核苷酸的方法，包括(a)将目标多核苷酸与跨膜孔以及本专利技术的dda解旋酶或构建体接触使得所述解旋酶控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动，并且(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述目标多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸；
16、-一种形成用于表征目标多核苷酸的传感器的方法，包括在(a)孔和(b)本专利技术的dda解旋酶或构建体之间形成复合体并由此形成用于表征目标多核苷酸的传感；
17、-用于表征目标多核苷酸的传感器，包括在(a)孔和(b)本专利技术的dda解旋酶或构建体之间的复合体；
18、-本专利技术的dda解旋酶或构建体在控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动中的应用；
19、-一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)本专利技术的dda解旋酶或构建体；
20、-一种用于表征样本中的目标多核苷酸的装置，包括(a)多个孔和(b)多个本专利技术的dda解旋酶或构建体；以及
21、连接到多核苷酸的两个或多个解旋酶的系列，其中所述两个或多个解旋酶的至少一个是本专利技术的dda解旋酶。
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1.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)Dda解旋酶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括含有两亲膜的芯片。
3.一种用于表征样本中的目标多核苷酸的装置，包括(a)多个孔和(b)多个Dda解旋酶。
4.根据权利要求3所述的装置，其中所述装置包括：
5.根据权利要求3所述的装置，其中所述装置包括：
6.根据权利要求3所述的装置，其中所述装置包括：
【技术特征摘要】
1.一种用于表征目标多核苷酸的试剂盒，包括(a)孔和(b)dda解旋酶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括含有两亲膜的芯片。
3.一种用于表征样本中的目标多核苷酸的装置，包括(...
【专利技术属性】
技术研发人员：马克·布鲁斯，安德鲁·约翰·赫伦，露丝·莫伊西，绍博尔奇·苏罗尔斯，伊丽莎白·杰恩·华莱士，詹姆斯·怀特，
申请(专利权)人：牛津纳米孔科技公开有限公司，
类型：发明
国别省市：
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