【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及一种使用生物孔检测和/或分析靶聚合物、尤其是靶多核苷酸的方法。本专利技术还涉及一种用于执行该方法的新系统。该方法具有很多用途。特别地，该方法可以用于诊断、多态性检测和v(d)j组库分析。
技术介绍
1、目前，广泛的应用需要快速且廉价的聚合物(例如，dna或rna)测序和识别技术。现有技术缓慢且昂贵，主要是因为它们依赖扩增技术来产生大量多核苷酸，并且需要大量专业荧光化学品来进行信号检测。
2、生物孔(和其他纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接电生物传感器具有巨大的潜力。特别地，最近已经关注到纳米孔作为潜在的dna测序技术。
3、当跨越纳米孔施加电位时，在分析物(诸如核苷酸)短暂驻留在桶中达某个时间段的情况下，电流发生变化。核苷酸的纳米孔检测给出了已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单条多核苷酸链穿过孔并得出核苷酸的身份。链测序可以涉及使用分子煞车来控制多核苷酸通过孔的运动。
4、固态孔已被用于使用含有cas9的探针来识别靶dna序列(yang等人,nanolett.2018,18,10,6469–6474和weckman等人,acs sens.2019,4,8,2065–2072)。
技术实现思路
1、本专利技术人已经确认了生物孔与引导聚合物(诸如rna和dna)以及聚合物引导的效应蛋白(诸如形成crispr基因编辑机制的一部分的rna引导的效应蛋白和dna引导的效应蛋白)的组合的新用途。特别地，本专利技术人设计了修
2、该方法可以以多种方式进行，但共同点是它们使用引导聚合物(诸如引导rna)和聚合物引导的效应蛋白(诸如rna引导的效应蛋白)来选择靶聚合物(诸如靶多核苷酸)，并且涉及将包含靶聚合物、引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白的复合物递送至生物孔。该方法可以扩展到其他聚合物引导的蛋白质效应系统，包括使用c2c2的rna编辑系统。引导聚合物，诸如引导rna，可以具体适合用于基于纳米孔的检测方法。
3、本专利技术人开发的方法是灵敏的并且可以用于检测样品中痕量的靶聚合物，而不需要单独的分离步骤来从样品中的其他组分中提取靶聚合物。因此，该方法简单并且不需要复杂的步骤，诸如富集或纯化步骤。因此，该方法是快速的并且可以用于获得快速结果以及从粗制和/或“脏”样品获得结果。因此，该方法在需要快速诊断的诊断环境中特别有用。该方法在靶向基因或基因组的特定片段或区域中也特别有用。该方法的一个主要益处是在测量靶标或衔接子之前不需要主动从靶聚合物中去除聚合物引导的效应蛋白。靶聚合物通常被检测或表征，同时仍与聚合物引导的效应蛋白结合。在一些实施例中，该方法使用专门设计的引导聚合物来促进靶聚合物与样品中的其他组分的分离。
4、该方法使得能够在含有许多其他聚合物序列的样品中对聚合物序列(诸如多核苷酸序列)中的目的区域进行表征，例如测序，因为其固有地包括分离步骤。例如，可以仅对大基因组中存在的目的基因进行测序。测序可以限于含有snp的区域，或其他目的区域，诸如t细胞中的v(d)j区域。这提高了灵敏度和效率，无需复杂或耗时的片段化或下拉样品制备方法即可访问所需信息。它还减少了进行纳米孔实验所花费的时间，因为仅测量目的靶聚合物(诸如靶多核苷酸)的片段，或者测量其相对于样品中的总聚合物片段增加的比例。当非靶聚合物的量超过靶聚合物的量时，由于去除了或减少了测量非靶聚合物的需要，因此可以显著减少检测靶聚合物所花费的时间。该方法还受益于不需要pcr或其他靶标富集方法。
5、本专利技术提供了：
6、-一种确定样品中靶聚合物的存在或不存在的方法，该方法包括：
7、a)使该样品与引导聚合物接触，该引导聚合物(i)与该靶聚合物的一部分结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中该引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与该样品中存在的任何靶聚合物形成复合物；
8、b)使该样品与包含生物孔的膜接触，该生物孔具有允许该复合物通过该孔的转位的开口；
9、c)跨越该膜施加电位差并进行一项或多项电测量；以及
10、d)监测由于该复合物通过该孔的转位而产生的电效应的存在或不存在，并且从而确定该样品中该靶聚合物的存在或不存在；以及
11、-一种用于确定样品中靶聚合物的存在或不存在的系统，该系统包括：
12、a)引导聚合物，其(i)若该靶聚合物存在，则与该靶聚合物的一部分结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中该引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与该样品中存在的任何靶聚合物形成复合物；以及
13、b)具有开口的生物孔，该开口允许该复合物通过该孔的转位。
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1.一种确定样品中靶聚合物的存在或不存在的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物的所述聚合物引导的效应蛋白部分通过所述孔的转位产生电效应，所述电效应和与所述复合物的转位通过所述孔的所述靶聚合物部分相关的电效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂中的一者或多者。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)包括跨越所述膜施加电位差并测量流过所述孔的电流。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述复合物的所述聚合物引导的效应蛋白部分通过所述孔的转位产生电流效应，所述电流效应和与所述复合物的转位通过所述孔的所述靶聚合物部分相关的电流效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂中的一者或多者。
5.根据权利要求2或4所述的方法，其中更复杂的电或电流效应包括(i)不一致效应、(ii)噪声和(iii)电步进事件中的一者或多者。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中在与所述聚合物引导的效应蛋白相关的所述电或电流效应之前和/或之后观察到与所述靶聚合物相关的所述电或电流效应。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶聚合物为靶多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶多核苷酸为双链的或包含双链区域和/或为DNA、DNA/RNA杂交体或RNA。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述引导聚合物为引导多核苷酸并且所述聚合物引导的效应蛋白为多核苷酸引导的效应蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述引导多核苷酸为引导RNA并且所述多核苷酸引导的效应蛋白为RNA引导的效应蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述RNA引导的效应蛋白为RNA引导的核酸内切酶或者其中RNA引导的核酸内切酶的核酸酶活性被禁用的所述RNA引导的核酸内切酶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Cas为Cas9。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述引导多核苷酸包含与所述靶聚合物中的序列结合的核苷酸序列和与所述多核苷酸引导的效应蛋白结合的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述引导多核苷酸为包含与所述靶多核苷酸中的序列结合的crRNA和tracrRNA的引导RNA。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述引导RNA为sgRNA。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述引导聚合物、所述聚合物引导的效应蛋白或在存在时的所述靶聚合物具有能够与所述膜偶联的锚。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述锚包含胆固醇。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使所述样品和所述孔与两个或更多个引导聚合物接触，所述两个或更多个引导聚合物中的每一个(i)与所述靶聚合物的一部分结合并且(ii)与两个或更多个聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中所述两个或更多个引导聚合物和两个或更多个聚合物引导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶聚合物形成两个或更多个复合物，并且步骤(d)包括监测由所述两个或更多个复合物通过所述孔的转位而产生的两个或更多个电或电流效应的存在或不存在，并且从而确定所述样品中所述靶聚合物的存在或不存在。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述两个或更多个引导聚合物与所述靶聚合物的不同部分结合。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述两个或更多个聚合物引导的效应蛋白是不同的聚合物引导的效应蛋白或不同的RNA引导的效应蛋白。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中在由所述两个或更多个复合物的转位通过所述孔的所述聚合物引导的效应蛋白部分产生的所述电或电流效应之间观察到与所述两个或更多个复合物的转位通过所述孔的所述靶聚合物部分相关的所述电或电流效应。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在所述靶聚合物存在时，确定所述靶聚合物的量或所述靶聚合物的一个或多个特征。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)所述靶聚合物的长度，(ii)所述靶聚合物的身份，(iii)所述靶聚合物的序列，(iv)所述靶聚合物的二级结构以及(v)所述靶聚合物是否被修饰。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述孔为天然存在的生物孔或天然存在的生物孔的修饰形式。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述天然存在的生物孔为补体成分...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种确定样品中靶聚合物的存在或不存在的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物的所述聚合物引导的效应蛋白部分通过所述孔的转位产生电效应，所述电效应和与所述复合物的转位通过所述孔的所述靶聚合物部分相关的电效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂中的一者或多者。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)包括跨越所述膜施加电位差并测量流过所述孔的电流。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述复合物的所述聚合物引导的效应蛋白部分通过所述孔的转位产生电流效应，所述电流效应和与所述复合物的转位通过所述孔的所述靶聚合物部分相关的电流效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂中的一者或多者。
5.根据权利要求2或4所述的方法，其中更复杂的电或电流效应包括(i)不一致效应、(ii)噪声和(iii)电步进事件中的一者或多者。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中在与所述聚合物引导的效应蛋白相关的所述电或电流效应之前和/或之后观察到与所述靶聚合物相关的所述电或电流效应。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶聚合物为靶多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶多核苷酸为双链的或包含双链区域和/或为dna、dna/rna杂交体或rna。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述引导聚合物为引导多核苷酸并且所述聚合物引导的效应蛋白为多核苷酸引导的效应蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述引导多核苷酸为引导rna并且所述多核苷酸引导的效应蛋白为rna引导的效应蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述rna引导的效应蛋白为rna引导的核酸内切酶或者其中rna引导的核酸内切酶的核酸酶活性被禁用的所述rna引导的核酸内切酶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述cas为cas9。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述引导多核苷酸包含与所述靶聚合物中的序列结合的核苷酸序列和与所述多核苷酸引导的效应蛋白结合的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述引导多核苷酸为包含与所述靶多核苷酸中的序列结合的crrna和tracrrna的引导rna。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述引导rna为sgrna。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述引导聚合物、所述聚合物引导的效应蛋白或在存在时的所述靶聚合物具有能够与所述膜偶联的锚。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述锚包含胆固醇。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使所述样品和所述孔与两个或更多个引导聚合物接触，所述两个或更多个引导聚合物中的每一个(i...
【专利技术属性】
技术研发人员：拉科马·尼尚萨·贾亚辛格，伊丽莎白·杰恩·华莱士，理查德·亚历山大·古铁雷斯，米歇尔·安妮·邓斯通，布拉德利·艾伦·斯派塞，
申请(专利权)人：牛津纳米孔科技公开有限公司，
类型：发明
国别省市：
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