【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、a.
2、纳米孔构建体及其在核酸测序中的用途。
3、b.相关技术的描述
4、最基本的是，纳米孔测序系统包括位于纳米孔附近的感测电极，使得感测电极可检测并且记录流过纳米孔的离子的电化学特性。当相对较大的分子占据纳米孔时，由感测电极检测到的电化学特性发生变化。然后可基于电化学特性的变化(诸如流过纳米孔的电流的变化或测量的电压的衰减)来确定对占据纳米孔的分子的鉴定。基于纳米孔的测序系统的概述可在wang i和feng中找到。
5、这些测序系统中使用的纳米孔通常具有以下三种类型中的一者：生物纳米孔、固态纳米孔和混合纳米孔。生物纳米孔为天然存在的成孔分子，尤其是诸如孔蛋白、溶血素等的蛋白质。常用的成孔蛋白包括来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素(αhl)蛋白、来自大肠杆菌的外膜蛋白g(ompg)和来自耻垢分枝杆菌的孔蛋白mspa(mspa)。在某些情况下，如ompg的情况下，孔由蛋白质的单个亚基形成。在其他情况下，如具有αhl和mspa，孔为成孔蛋白的多亚基组装体。例如，αhl形成七聚体孔结构并且mspa形成八聚体孔结构。基于这些蛋白质的示例性工程化纳米孔可在以下中找到：例如，wo 2016/069806(αhl)、wo 2017/050728(αhl)、wo 2017/184866(αhl)、wo 2018/002125(αhl)、wo 2012/178097(αhl)、gari(ompg)、wo2017/050722(ompg)、us 2015-0080242(ompg
6、基于纳米孔的核酸测序的一种方法涉及将单链核酸直接穿过孔(本文称为“直接测序”)。每种核苷酸(或核苷酸的独特组合)在孔的至少一种电化学特性中生成独特的变化。这些系统经常使用控制核酸易位通过孔的速率的方法，诸如将酶束缚到孔(包括聚合酶和解旋酶)、从孔通道去除带负电荷的残基并且向孔通道添加带正电荷的残基，以及将双链区域添加到单链核酸。例如，feng、manrao和wang i讨论了示例性直接测序方法。
7、另一种方法涉及边合成边测序(sbs)方法，通过在具有带标签的核苷酸多磷酸分子的纳米孔的开口附近进行聚合酶催化的扩增反应。每个带标签的核苷酸多磷酸都包含一个独特的标记部分，当它驻留在纳米孔内或附近时，会生成独特的电化学特征。当带标签的核苷酸多磷酸被掺入扩增子时，标签被传递到纳米孔中或纳米孔附近，并且记录标签的电化学特征。扩增子的序列源自标签部分进入纳米孔的顺序。用于进行此类方法的示例性基于标签的sbs方法和材料描述于：例如，wo 2012-083249、wo 2013/154999、us 2014/0309144、us 9,017,937、wo 2015/148402、wo 2016/069806、wo 2016/144973、us 2016/0222363、us 2016/0333327、wo 2017/050728、wo 2017/184866、wo 2017/050722、us 2017/0267983、us 2018/0245147、us 2018/0094249、wo 2018/002125和kumar。已经建议在此类系统中使用各种标签，包括基于多肽的标签(诸如多聚赖氨酸标签)和多核苷酸。参见，例如us 8,652,779和wo2017042038a1。
技术实现思路
1、本文公开了具有穿过纳米孔的通道的带电荷的聚合物的工程化纳米孔，以及它们在基于纳米孔的测序系统和方法中的用途。已发现，带电荷的聚合物的包含显着增加了孔的电导，由此有助于区分测序运行期间占据孔的不同分子(诸如核苷酸或聚合物标签的组)。
2、在实施方案中，提供了带电荷的聚合物连接的纳米孔(cpl-纳米孔)，该cpl-纳米孔包括具有入口侧和出口侧的通道；以及穿过通道的带电荷的聚合物，该带电荷的聚合物包括设置在通道的基本上整个长度中并且延伸穿过该通道的带负电荷的区域。在一些实施方案中，带电荷的聚合物的第一端在通道的入口侧附近固定就位，并且带电荷的聚合物的第二端在通道的出口侧附近固定就位。示例性纳米孔包括基于α-溶血素(αhl)、外膜孔蛋白g(ompg)、耻垢分枝杆菌孔蛋白a(mspa)、杀白细胞素纳米孔、外膜孔蛋白f(ompf)纳米孔、溶细胞素a(clya)纳米孔、外膜磷脂酶a纳米孔、奈瑟菌自转运脂蛋白(nalp)纳米孔、wza纳米孔、皮疽诺卡氏菌(nocardia farcinica)nfpa/nfpb阳离子选择性通道纳米孔、溶素(lysenin)纳米孔、气单胞菌溶素(aerolysin)和curlinσs依赖性生长亚基g(csgg)纳米孔。在示例性实施方案中，生物纳米孔为基于αhl的七聚纳米孔，其中该七聚纳米孔包含7个单体亚基，每个单体亚基包含与seq id no:1具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
3、在另一个实施方案中，提供了用于进行基于纳米孔的核酸测序的系统。该系统通常包括本文公开的cpl-纳米孔和可用于区分占据纳米孔的分子的其他元件。
4、在另一个实施方案中，提供了使用cpl-纳米孔进行基于纳米孔的核酸测序的方法。
5、本文详细描述了其他细节和专利技术。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种纳米孔形成蛋白，其包括：
2.根据权利要求1所述的纳米孔形成蛋白，其中所述通道由7个单体亚基形成，每个单体亚基与SEQ ID NO:1具有至少75％序列同一性，并且其中所述第一端与所述7个单体亚基中的一个共价结合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述带电述的纳米孔形成蛋白，其中所荷的聚合物的所述第二端包含生物素或生物素衍生物，并且其中所述生物素或生物素衍生物固定到设置在所述通道的所述出口侧上的亲和素、链霉亲和素或去糖基化亲和素。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的纳米孔形成蛋白，其中所述带电荷的聚合物的所述第二端包含抗体表位，并且其中所述抗体表位固定到设置在所述通道的所述出口侧上的抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米孔形成蛋白，其中所述带负电荷的区域包含至少10个磷酸二酯键。
6.根据权利要求5所述的纳米孔形成蛋白，其中所述磷酸二酯键连接核苷酸和/或脱碱基位点。
7.根据权利要求6所述的纳米孔形成蛋白，其中所述带负电荷的区域包含至少10个脱碱基位点。
8.根据权利要求6所述的
9.根据权利要求6至8中任一项所述的纳米孔形成蛋白，其中所述脱碱基位点具有以下结构：
10.根据权利要求2至9中任一项所述的纳米孔形成蛋白，其中当与SEQ ID NO:1比对形成时，所述7个亚基中的至少6个包含D111、M113和K147。
11.一种用于进行基于纳米孔的测序的系统，所述系统包括包含多个纳米孔测序复合体的芯片和适合于记录所述纳米孔测序复合体的一个或多个电特性的变化的计算系统，其中每个纳米孔测序复合体包含：
12.一种在根据权利要求11所述的系统上对模板核酸进行测序的方法，所述方法包括：
13.一种用于进行边合成边测序(SBS)核酸测序的系统，所述系统包括包含多个纳米孔测序复合体的芯片和适合于记录所述纳米孔测序复合体的一个或多个电特性的变化的计算系统，其中每个纳米孔测序复合体包含：
14.一种在根据权利要求13所述的系统上对模板核酸进行测序的方法，所述方法包括：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种纳米孔形成蛋白，其包括：
2.根据权利要求1所述的纳米孔形成蛋白，其中所述通道由7个单体亚基形成，每个单体亚基与seq id no:1具有至少75％序列同一性，并且其中所述第一端与所述7个单体亚基中的一个共价结合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述带电述的纳米孔形成蛋白，其中所荷的聚合物的所述第二端包含生物素或生物素衍生物，并且其中所述生物素或生物素衍生物固定到设置在所述通道的所述出口侧上的亲和素、链霉亲和素或去糖基化亲和素。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的纳米孔形成蛋白，其中所述带电荷的聚合物的所述第二端包含抗体表位，并且其中所述抗体表位固定到设置在所述通道的所述出口侧上的抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米孔形成蛋白，其中所述带负电荷的区域包含至少10个磷酸二酯键。
6.根据权利要求5所述的纳米孔形成蛋白，其中所述磷酸二酯键连接核苷酸和/或脱碱基位点。
7.根据权利要求6所述的纳米孔形成蛋白，其中所述带负电荷的区域包含至少10个脱碱基位点。
【专利技术属性】
技术研发人员：申盛浩，M·C·唐，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：
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