【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫毒性分析，具体涉及一种3d共培养球状体及其构建方法和应用、免疫毒性评价方法。
技术介绍
1、免疫系统是污染物风险评估的敏感靶标，在当前日益严峻的环境污染问题下，对于环境污染物的免疫毒性评价显得尤为重要。肺作为人体吸入环境污染物的主要通道，发挥了重要的免疫防御作用，因此肺部免疫毒性的评价尤为关键。目前常用的肺部毒性评价模型有动物模型和2d细胞培养细胞。
2、动物模型能够提供与人类细胞和器官系统相似的复杂生理结构，但由于物种之间的差异，动物模型的研究结果通常难以准确反映人类的实际情况，且动物模型受到伦理问题的制约。传统的2d细胞培养细胞通常被培养在平坦的聚苯乙烯或玻璃培养皿，难以模拟体内真实环境中组织的复杂性，使得传统的2d细胞培养细胞在预测人体对环境污染物的反应时存在一定的局限性，难以准确评估环境污染物对肺部免疫系统的影响。因此，亟需开发一种能够模拟真实肺部微环境的肺部毒性评价模型，进而可以更准确地评估环境污染物对肺部免疫系统的影响。
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提出一种3d共培养球状体的构建方法，通过多种肺部细胞的相互作用和采用3d细胞培养技术进行培养，能够构建得到在结构和功能上接近人体肺部的实际情况的3d共培养球状体，能够更真实和可靠地模拟人体肺部对环境污染物的免疫响应，弥补了2d细胞培养技术和传统动物模型的局限性。
2、本专利技术的另一目的在于提出一种3d共培养球状体，由上述构建方法构建得到，3d共培养
3、本专利技术的又一目的在于提出了3d共培养球状体在进行免疫毒性评价中的应用。
4、本专利技术的再一目的在于提出一种基于3d共培养球状体的免疫毒性评价方法，能够更准确地评估环境污染物对肺部免疫系统的影响，解决了采用2d细胞培养技术和传统动物模型进行免疫毒性评价，难以准确评估环境污染物对人体肺部免疫系统的影响的问题。
5、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
6、一种3d共培养球状体的构建方法，包括以下步骤：
7、(1)用佛波酯处理thp-1细胞，分化48～96h后得到thp-1细胞；
8、(2)分别用胰蛋白酶消化beas-2b细胞、mrc-5细胞和thp-1细胞，将消化后的beas-2b细胞、mrc-5细胞和thp-1细胞混合，得到混合细胞悬液；
9、(3)将混合细胞悬液接种到超低附着板中进行培养，得到3d共培养球状体。
10、优选地，在步骤(2)中，beas-2b细胞、mrc-5细胞和thp-1细胞按细胞数量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)的比例进行混合。
11、一种3d共培养球状体，由上述的3d共培养球状体的构建方法构建得到。
12、上述的3d共培养球状体在制备模拟环境污染物对免疫毒性的模型中的用途。
13、上述的3d共培养球状体在体外肺部免疫毒性评价中的用途。
14、一种基于3d共培养球状体的免疫毒性评价方法，使用上述的3d共培养球状体，或包括了上述的3d共培养球状体的构建方法，还包括如下步骤：
15、s1、将3d共培养球状体在待测污染物中暴露72～120h；
16、s2、对暴露前后的3d共培养球状体进行形态学分析；
17、s3、对步骤s1的3d共培养球状体进行免疫细胞的追踪、细胞活力检测、dna损伤情况检测、细胞因子表达情况检测和抗感染能力检测中的一种或多种组合；
18、s4、根据步骤s2得到的分析和步骤s3得到的检测结果，评估待测污染物的肺部免疫毒性。
19、优选地，步骤s2对暴露前后的3d共培养球状体进行形态学分析的方法包括如下步骤：
20、在3d共培养球状体的构建方法的步骤(2)前，先使用细胞示踪剂进行荧光染色，在室温下的黑暗条件下孵育；
21、使用配备水浸物镜的高内涵成像系统拍摄图像，利用harmony软件评估3d肺部球状体在未暴露至暴露一段时间后的形态学变化，分析参数包括：面积、周长、长度、长宽比和紧凑度中的一种或多种，以分析待测污染物对3d共培养球状体的影响。
22、优选地，所述细胞活力检测中，采用细胞计数试剂试剂盒，在暴露结束后的孔板中加入cck-8溶液，孵育一段时间，随后使用酶标仪在450nm波长下测量吸光度；通过测量吸光度评估细胞的代谢活性，以确认待测污染物对细胞活力的影响，细胞毒性越小，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
23、优选地，所述dna损伤情况检测包括如下步骤：取暴露于待测污染物后的细胞上清液，使用人8-羟基-2'-脱氧鸟苷酶联免疫吸附试验试剂盒，测量8-ohdg的水平，以确认dna受到氧化损伤的程度。
24、优选地，所述细胞因子表达情况检测包括如下步骤：使用elisa试剂盒检测步骤s1的3d共培养球状体的上清液中炎症细胞因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达水平。
25、优选地，所述抗感染能力检测的方法包括如下步骤：将步骤s1的3d共培养球状体暴露于嗜肺军团菌悬液中，细胞与细菌的比例为1：(90～110)，经暴露后，然后利用聚合酶链式反应绝对定量法测定细胞对细菌的抗感染能力。
26、本申请实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
27、1、本技术方案通过多种肺部细胞的相互作用和采用3d细胞培养技术能够构建得到在结构和功能上接近人体肺部的实际情况的3d共培养球状体，使本技术方案构建得到的3d共培养球状体能够更真实、可靠地模拟人体肺部对环境污染物的免疫响应，更为客观真实地反映污染物的毒性风险，对污染物的免疫毒性机制研究也具有重要意义。
28、2、本技术方案的基于3d共培养球状体的免疫毒性评价方法，能够更准确评估环境污染物对肺部免疫系统的影响，弥补了2d细胞培养技术和传统动物模型的局限性。本技术方案的免疫毒性评价方法利用3d共培养球状体，能够更真实地模拟肺部微环境，为环境毒性评价提供了更可靠的工具，并且本技术方案的免疫毒性评价方法，使用了综合的免疫毒性评价体系，包括形态学分析、免疫细胞的追踪、细胞活力检测、dna损伤情况检测、细胞因子检测和抗感染能力检测，综合评价了环境污染物的免疫毒性，能够全面、准确地评估环境污染物在3d肺部组织中的毒性作用，为毒性评价提供了多方面的数据支持。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种3D共培养球状体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的3D共培养球状体的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，BEAS-2B细胞、MRC-5细胞和THP-1mφs细胞按细胞数量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)的比例进行混合。
3.一种3D共培养球状体，其特征在于，由权利要求1或2所述的3D共培养球状体的构建方法构建得到。
4.权利要求3所述的3D共培养球状体在制备模拟环境污染物对免疫毒性的模型中的用途。
5.一种基于3D共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，使用权利要求3所述的3D共培养球状体，或包括了权利要求1或2所述的3D共培养球状体的构建方法，还包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的基于3D共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，步骤S2对暴露前后的3D共培养球状体进行形态学分析的方法包括如下步骤：
7.根据权利要求5所述的基于3D共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，所述细胞活力检测中，采用细胞计数试剂试剂盒，在暴露结束
8.根据权利要求5所述的基于3D共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，所述DNA损伤情况检测包括如下步骤：取暴露于待测污染物后的细胞上清液，使用人8-羟基-2'-脱氧鸟苷酶联免疫吸附试验试剂盒，测量8-OhdG的水平，以确认DNA受到氧化损伤的程度。
9.根据权利要求5所述的基于3D共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，所述细胞因子表达情况检测包括如下步骤：使用ELISA试剂盒检测步骤S1的3D共培养球状体的上清液中炎症细胞因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达水平。
10.根据权利要求5所述的基于3D共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，所述抗感染能力检测的方法包括如下步骤：将步骤S1的3D共培养球状体暴露于嗜肺军团菌悬液中，细胞与细菌的比例为1：(90～110)，经暴露后，然后利用聚合酶链式反应绝对定量法测定细胞对细菌的抗感染能力。
...【技术特征摘要】
1.一种3d共培养球状体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的3d共培养球状体的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，beas-2b细胞、mrc-5细胞和thp-1mφs细胞按细胞数量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)的比例进行混合。
3.一种3d共培养球状体，其特征在于，由权利要求1或2所述的3d共培养球状体的构建方法构建得到。
4.权利要求3所述的3d共培养球状体在制备模拟环境污染物对免疫毒性的模型中的用途。
5.一种基于3d共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，使用权利要求3所述的3d共培养球状体，或包括了权利要求1或2所述的3d共培养球状体的构建方法，还包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的基于3d共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，步骤s2对暴露前后的3d共培养球状体进行形态学分析的方法包括如下步骤：
7.根据权利要求5所述的基于3d共培养球状体的免疫毒性评价方法，其特征在于，所述细胞活力检测中，采用细胞计数试剂试剂盒，在暴露结束后的孔板中加入cck-8...
【专利技术属性】
技术研发人员：周义鸾，李心砚，郑爽，沈权猷，栾天罡，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。