【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，更具体地说，本专利技术涉及一种基于梁山慈竹转录组序列开发的est-ssr分子标记、引物组、试剂盒及应用。
技术介绍
1、竹类植物是禾本科中最大的自然类群，全世界约有88属1400种，中国有34属近550种，在经济、农业、环境中都发挥着巨大的作用。由于竹子极少开花，繁殖器官难以获得，在传统分类方法中常用的外部形态特征会因环境改变而发生各种各样的变化。因此，竹子分类是竹子研究中的突出问题之一。分子标记技术为竹子系统分类的深入开展提供了新的依据。ssr标记是基于dna长度多态性的分子标记技术，广泛应用于群体遗传结构分析、构建遗传图谱、基因定位、亲缘关系等领域。表达序列标签ssr(est-ssr)是基于est开发出的第二代分子标记。est-ssr来自于基因的编码序列，更容易获得基因表达的信息表达，与基因组ssr(g-ssr)标记相比，具有物种间通用性较好、开发方法简单及成本低廉等优点。但是竹类植物中开发的ssr引物较少，检测的ssr位点不足以满足种质鉴定及群体遗传研究的需要，因而需要开发更多的竹类植物ssr引物，来扩大竹类植物种质鉴定的数量和范围及进行系统分类、群体遗传等研究。ssr标记也是植物辅助育种和种质鉴定的重要分子标记之一。通过追踪检测目的基因相关联的ssr分子标记进行植物分子标记辅助育种，可以明显缩短育种时间，提高育种的效率。
2、梁山慈竹(dendrocalamus farinosus)是我国西南地区重要浆用竹种，具有成材期短、单株产量高和纤维制浆品质好等重要特性，是速生型植物资源。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
2、为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种基于梁山慈竹转录组序列开发的est-ssr分子标记，其编号依次为c2、c3、c8、l1、l2、l6、l7、l10、l26、l30、l32、l35、p4、p12、p15、p17、r2、r8、r68、r71、r83；
3、所述est-ssr分子标记c2、c3、c8、l1、l2、l6、l7、l10、l26、l30、l32、l35、p4、p12、p15、p17、r2、r8、r68、r71、r83分别通过以下引物对扩增得到：seq id no.1-2、seq idno.3-4、seq id no.5-6、seq id no.7-8、seq id no.9-10、seq id no.11-12、seq idno.13-14、seq id no.15-16、seq id no.17-18、seq id no.19-20、seq id no.21-22、seqid no.23-24、seq id no.25-26、seq id no.27-28、seq id no.29-30、seq id no.31-32、seq id no.33-34、seq id no.35-36、seq id no.37-38、seq id no.39-40和seq idno.41-42所示的引物。
4、优选的是，所述est-ssr分子标记中与梁山慈竹茎秆干重和胸径相关联的分子标记编号为l1和l26。
5、一种基于梁山慈竹转录组序列开发的est-ssr引物组，包括核苷酸序列分别如seqid no.1-42所示的21对引物对。
6、一种如上所述的基于梁山慈竹转录组序列开发的est-ssr引物组的应用，包括以下步骤：
7、步骤一、提取待测植株的基因组dna；
8、步骤二、以待测植株的基因组dna为模版，利用est-ssr引物组，进行pcr扩增反应，得到pcr扩增产物；
9、步骤三、检测pcr扩增产物，根据扩增条带的多态性，进行聚类分析。
10、优选的是，所述步骤一中，提取待测植株的基因组dna的具体方法为：取0.2g幼嫩叶片，除去叶脉，放置于2.0ml的ep管中，加入液氮充分研磨至粉状，再加入65℃预热的ctab溶液600μl，65℃水浴30min；然后在4℃下12000rpm离心10min，吸取500μl上清液转入新ep管，加入等体积的氯仿抽提，12000rpm离心2min；吸取上清液转入新ep管，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，充分混匀后在-20℃条件下静置20min，进行核酸沉淀；弃去上清液，加入70％无水乙醇500μl，轻微摇晃使附于管壁的dna沉淀脱离，以便充分洗涤，然后倒掉上清液，保留dna沉淀，重复2次后将ep管倒扣于吸水纸上自然风干8～15min，加入25μl ddh2o溶解，得到基因组dna，保存于-20℃冰箱备用。
11、优选的是，所述步骤二中，pcr扩增体系包括：ssr-pcr反应预混液11μl，est-ssr引物2μl，dna模板2μl，ddh2o 5μl；pcr反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，50～65℃退火30s，72℃延伸2min，36个循环；72℃延伸10min，10℃保存。
12、优选的是，所述步骤三中，检测pcr扩增产物：用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pcr扩增产物，电泳完成后，利用agno3染色，naoh和甲醛显色，最后拍照记录；
13、聚类分析的具体方法为：
14、s31、读取与记录扩增条带、以0、1统计建立数据库：从大到小依次记录，相同迁移率位置上，有谱带记为“1”，无谱带记为“0”；
15、s32、数据处理：通过ntsys-pc软件进行遗传相似系数计算，通过upgma法进行遗传相似性聚类，通过popgene软件计算观察，得到等位基因数、shannon信息指数、有效等位基因数、nei’s基因多样性。
16、一种试剂盒，包括如上所述的est-ssr引物组。
17、优选的是，所述试剂盒还包括ssr-pcr反应预混液；所述ssr-pcr反应预混液含有：rtaq聚合酶，dntp mix、2×gc buffer和ddh2o。
18、一种如上所述的试剂盒在竹子系统分类或遗传多样性分析中的应用。
19、本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术中的est-ssr引物及对应的est-ssr分子标记是基于不同发育阶段梁山慈竹笋转录组数据开发的est序列，并通过37个不同基因型梁山慈竹样本和来自于牡竹属和勒竹属的15个不同竹种提取的竹子叶片dna开展pcr扩增和测序，进行了扩增效率、多态性及通用性检测。本专利技术结合不同发育阶段梁山慈竹笋的差异基表达基因的wgcna分析，揭示了大量的细胞壁本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于梁山慈竹转录组序列开发的EST-SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记的编号依次为C2、C3、C8、L1、L2、L6、L7、L10、L26、L30、L32、L35、P4、P12、P15、P17、R2、R8、R68、R71、R83；
2.一种基于梁山慈竹转录组序列开发的EST-SSR引物组，其特征在于，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-42所示的21对引物对。
3.一种如权利要求2所述的基于梁山慈竹转录组序列开发的EST-SSR引物组的应用，其特征在于，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的基于梁山慈竹转录组序列开发的EST-SSR引物组的应用，其特征在于，所述步骤一中，提取待测植株的基因组DNA的具体方法为：取0.2g幼嫩叶片，除去叶脉，放置于2.0mL的EP管中，加入液氮充分研磨至粉状，再加入65℃预热的CTAB溶液600μL，65℃水浴30min；然后在4℃下12000rpm离心10min，吸取500μL上清液转入新EP管，加入等体积的氯仿抽提，12000rpm离心2min；吸取上清液转入新EP管，加入等体积-20℃
5.如权利要求3所述的基于梁山慈竹转录组序列开发的EST-SSR引物组的应用，其特征在于，所述步骤二中，PCR扩增体系包括：SSR-PCR反应预混液11μL，EST-SSR引物2μL，DNA模板2μL，ddH2O 5μL；PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，50～65℃退火30s，72℃延伸2min，36个循环；72℃延伸10min，10℃保存。
6.如权利要求3所述的基于梁山慈竹转录组序列开发的EST-SSR引物组的应用，其特征在于，所述步骤三中，检测PCR扩增产物：用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳完成后，利用AgNO3染色，NaOH和甲醛显色，最后拍照记录；
7.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的EST-SSR引物组。
8.如权利要求7所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括SSR-PCR反应预混液；所述SSR-PCR反应预混液含有：rTaq聚合酶，dNTP mix、2×GC buffer和ddH2O。
9.一种如权利要求7～8任一项所述的试剂盒在竹子系统分类或遗传多样性分析中的应用。
10.如权利要求1所述的一种基于梁山慈竹转录组序列开发的EST-SSR分子标记，其特征在于，所述EST-SSR分子标记中与梁山慈竹茎秆干重和胸径相关联的分子标记编号为L1和L26。
...【技术特征摘要】
1.一种基于梁山慈竹转录组序列开发的est-ssr分子标记，其特征在于，所述分子标记的编号依次为c2、c3、c8、l1、l2、l6、l7、l10、l26、l30、l32、l35、p4、p12、p15、p17、r2、r8、r68、r71、r83；
2.一种基于梁山慈竹转录组序列开发的est-ssr引物组，其特征在于，包括核苷酸序列分别如seq id no.1-42所示的21对引物对。
3.一种如权利要求2所述的基于梁山慈竹转录组序列开发的est-ssr引物组的应用，其特征在于，包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的基于梁山慈竹转录组序列开发的est-ssr引物组的应用，其特征在于，所述步骤一中，提取待测植株的基因组dna的具体方法为：取0.2g幼嫩叶片，除去叶脉，放置于2.0ml的ep管中，加入液氮充分研磨至粉状，再加入65℃预热的ctab溶液600μl，65℃水浴30min；然后在4℃下12000rpm离心10min，吸取500μl上清液转入新ep管，加入等体积的氯仿抽提，12000rpm离心2min；吸取上清液转入新ep管，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，充分混匀后在-20℃条件下静置20min，进行核酸沉淀；弃去上清液，加入70％无水乙醇500μl，轻微摇晃使附于管壁的dna沉淀脱离，以便充分洗涤，然后倒掉上清液，保留dna沉淀，重复2次后将ep管倒扣于吸水纸上自然风干8～15min，加入25μl ddh...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹颖，胡尚连，陈森，王博雅，龙治坚，赵欣，唐登国，
申请(专利权)人：西南科技大学，
类型：发明
国别省市：
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