一种耐热性增强的谷胱甘肽合成酶及应用制造技术

本发明专利技术涉及酶催化技术领域，尤其是一种耐热性增强的谷胱甘肽合成酶及应用，所述谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。使用时，反应体系pH7.0，含有硫酸镁、六偏磷酸钠、甘氨酸及谷氨酸钠、L

【技术实现步骤摘要】
一种耐热性增强的谷胱甘肽合成酶及应用


[0001]本专利技术涉及酶催化
，具体领域为一种耐热性增强的谷胱甘肽合成酶及应用。

技术介绍

[0002]谷胱甘肽(γ
‑
谷氨酰
‑
L
‑
半胱氨酸甘氨酸，GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽分子，缩写为GSH，是一种重要的非蛋白质硫醇化合物，广泛分布于生物体中。它在维持细胞氧化还原平衡、活性氧的解毒和抵御氧化应激方面发挥着至关重要的作用。此外，生物体内高浓度的谷胱甘肽可以抵抗重金属离子，并适应环境条件。因此，它在土壤和水的生物修复中具有潜在的应用。谷胱甘肽对氧化损伤的保护作用也已在乳酸菌中得到证实。例如，补充谷胱甘肽增强了乳酸菌对酸、冷和渗透胁迫的耐受性。除了谷胱甘肽作为氧化应激反应一部分的作用外，γ
‑
谷氨酰肽还包括谷胱甘肽、γ
‑
Glu
‑
Cys、γ
‑
Glu
‑
Glu、γ
‑
Glu
‑
Gly、γ
‑
Glu
‑
Gln、γ
‑
Glu
‑
Met和γ
‑
Glu
‑
Leu激活人类钙敏感受体(CasR)，增强和扩展对咸味、鲜味和甜味等主要味道的感知。谷胱甘肽在制药、化妆品和食品工业中有各种应用。近年来，对GSH的需求逐年增加。
[0003]谷胱甘肽的工业生物合成主要有两种方式，发酵和酶催化。这些过程的关键因素是以三种前体氨基酸(即L
‑
谷氨酸，L
‑
半胱氨酸和甘氨酸)的两次连续ATP消耗反应进行的。谷胱甘肽的合成是一个两步酶反应，每一步消耗一个ATP分子，是一个大量消耗ATP的过程。γ
‑
谷氨酰半胱氨酸连接酶或γ
‑
谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ
‑
Gcl，EC 6.3.2.2)将半胱氨酸连接到谷氨酸，谷胱甘肽合成酶(GS，EC 6.3.2.3)催化甘氨酸与γ
‑
谷氨酰半胱氨酸连接，产生三肽谷胱甘肽。只有还原型谷胱甘肽才具有生物活性。两个还原GSH分子脱氢，而后二硫化键形成氧化型GSH(GSSG)。GSSG可以通过消耗NADPH通过GSH还原酶还原为活性还原GSH。众所周知，γ
‑
GCS催化大多数真核和原核细胞中GSH合成的反应被GSH抑制，而双功能GSH合成酶(GshF)即使在20mM时对GSH引起的反馈抑制也不敏感。因此，最近已有学者将新型双功能酶的GshF编码应用于通过发酵或酶促反应产生GSH。传统上，存在于大肠杆菌、产朊假丝酵母和酿酒酵母中的这些酶是γ
‑
l
‑
戊二酸
‑
l
‑
半胱氨酸合成酶(γ
‑
GCS)和l
‑
谷胱甘肽合成酶(GS)。γ
‑
GCS和GS在不同宿主菌株中的过表达可以改善GSH的形成。然而，γ
‑
GCS的活性受到GSH的严重反馈抑制，导致GSH生物合成的速率限制和细胞内GSH积累的减少。
[0004]为了提高GSH产量并改善工艺性能，多个实验室已经研究了野生型菌株的诱变或工艺优化。如有研究者构建了两种分别过表达gshA和gshB的重组大肠杆菌菌株，积累了约5克/升的谷胱甘肽。加入SDS可以显著增强GSH的产生，可能是因为这种处理大大提高了细胞膜结构的通透性，随后GSH被释放到培养基中，对GSH的反馈抑制作用得到部分缓解。此外，有学者提出了使用渗透酵母细胞的两阶段反应，可以有效降低GSH的反馈抑制。
[0005]另一种提高谷胱甘肽产量的策略是使用具有较少反馈抑制的新型酶来代替γ
‑
GCS和GS。前者已有实验室分离和研究了几种同时具有γ
‑
GPS和GS功能的双功能谷胱甘肽
合成酶(GSH
‑
FS)。此外，一些GshFS被证明对Gsh抑制不敏感。如在组成型启动子的控制下，成功地将嗜热链球菌的GshF表达到转基因烟草中，并在其叶片中积累了极高水平的谷胱甘肽。在毕赤酵母中表达单核细胞增多性李斯特菌GshF可以显著减少γ
‑
GC的积累。在一些革兰氏阳性细菌中，编码双功能蛋白gshAB/gshF的单个基因(由N端的Gcl结构域和C端的GS结构域组成)介导γ
‑
谷氨酰二肽和谷胱甘肽的生物合成。编码多结构域双功能蛋白GshAB/GshF的基因首先在无乳链球菌和李斯特菌中发现，但也存在于嗜热链球菌和肠球菌属中。迄今为止，大多数预测编码gshAB/gshF都是病原体菌株。
[0006]华东理工大学对携带嗜热链球菌GshF的重组大肠杆菌菌株进行了Gsh的酶促合成研究，并做出巨大贡献。质粒的不同拷贝数和启动子强度会影响蛋白质的表达水平，并进一步影响酶活性和途径的通量。pET、pTrc和pUC的载体系列具有不同的拷贝数和诱导启动子(分别为T7、pTrc和Plac)，已成功用于大肠杆菌中靶蛋白的过量生产和代谢途径的修饰。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种耐热性增强的谷胱甘肽合成酶及应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种耐热性增强的谷胱甘肽合成酶，所述谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]本专利技术的耐热性增强的谷胱甘肽合成酶可用于催化L
‑
半胱氨酸中的应用，其使用方法为：反应体系pH7.0，含有硫酸镁、六偏磷酸钠、甘氨酸及谷氨酸钠、L
‑
半胱氨酸盐酸盐、AMP钠盐，加入谷胱甘肽合成酶的粗酶液及耐热型多聚磷酸激酶，30～45℃反应。
[0011]其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
[0012](1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
[0013](2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
[0014]①
摇瓶发酵
[0015]挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L；
[0016]次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5
‑
6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐热性增强的谷胱甘肽合成酶，其特征在于：所述谷胱甘肽合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.权利要求1所述耐热性增强的谷胱甘肽合成酶在催化L
‑
半胱氨酸中的应用。3.根据权利要求2所述的耐热性增强的谷胱甘肽合成酶在催化L
‑
半胱氨酸中的应用，其特征在于：反应体系pH7.0，含有硫酸镁、六偏磷酸钠、甘氨酸及谷氨酸钠、L
‑
半胱氨酸盐酸盐、AMP钠盐，加入谷胱甘肽合成酶的粗酶液及耐热型多聚磷酸激酶，30～45℃反应。4.根据权利要求3所述的耐热性增强的谷胱甘肽合成酶在催化L
‑
半胱氨酸中的应用，其特征在于：所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
①
摇瓶发酵挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L；次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5
‑
6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加IPTG至终...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，钱明，倪铭宏，韦淮，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：