一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法；所述方法以异麦芽酮糖为底物，利用可表达甘露醇脱氢酶的重组细胞转化生产异麦芽酮糖醇，其中甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，比酶活为5U/mg；结果显示，利用本发明专利技术的转化方法，异麦芽酮糖醇产率可达到7.8％，时空产率可达到36mg/L

【技术实现步骤摘要】
一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用全细胞转化生成异麦芽酮糖醇的方法。

技术介绍

[0002]蔗糖替代品，即代糖；相较于其它代糖(如赤藓糖醇等)，异麦芽酮糖醇被认为是蔗糖的“理想替代品”。在感官特性方面：尽管异麦芽酮糖醇的甜度仅有蔗糖的一半，但其具有与蔗糖相同或相似的甜味，无不良风味；在物化特性方面：异麦芽酮糖醇具有低吸湿性，高热、酸、碱耐受性，赋形性能好，在糖果、巧克力等产品中可以与蔗糖1:1替换而不需要改变配方和更换设备；在生理特性方面：异麦芽酮糖醇安全性高，世界多国对其使用范围和每日摄入量不做限制，不致龋齿、在体内的代谢不依赖于胰岛素，可供儿童、高血糖、糖尿病及肥胖人群食用。此外，异麦芽酮糖醇被报道具有益生元特性，能促进肠道益生菌(如双歧杆菌)增殖和短链脂肪酸产生，后者被证实具有抗炎、抗癌、增强免疫等作用。上述研究为异麦芽酮糖醇替代或部分替代蔗糖提供了充分的理论依据。因此，异麦芽酮糖醇作为一种新型的功能性糖醇，被广泛应用在食品领域中。
[0003]当前，异麦芽酮糖醇依赖于传统化学酶法合成，即以蔗糖为原料，通过蔗糖异构酶(Sucrose isomerase,SIase)催化生成异麦芽酮糖及杂糖(如海藻酮糖)，经除杂、脱色、浓缩、结晶等获得异麦芽酮糖晶体；而后再将异麦芽酮糖晶体溶解，在高温(140
‑
200℃)、高压(8.5
‑
10.0MPa)、雷尼镍、加氢条件下还原为异麦芽酮糖醇；再经浓缩、结晶、粉碎、造粒等工艺获得异麦芽酮糖醇。此工艺不仅要求高温、高压、加氢等危险性工艺，而且还存在过程繁杂、转化率低、环境污染和资源浪费等问题。说明当前传统化学酶法生产异麦芽酮糖醇的方式，已不符合我国工业转型升级和结构优化的发展趋势。
[0004]合成生物学这一新兴交叉学科的发展为多种化合物的绿色、高效、经济生产提供了新途径，已在天然活性成分(如青蒿素)、平台化合物(如1,4
‑
丁二醇)、食物营养成分(如淀粉、蛋白质)等方面取得了令人瞩目的成果。相较于传统化学合成，生物合成主要通过生物体的代谢来合成特定成分，具有反应选择性强、反应速率高、反应条件温和、环境污染小、适用于大规模生产等优点。
[0005]因此，生物法合成或许为异麦芽酮糖醇的绿色、高效、经济生产提供了新思路。

技术实现思路

[0006]本专利技术第一方面的目的，在于提供甘露醇脱氢酶或其相关生物材料的应用。
[0007]本专利技术第二方面的目的，在于提供一种甘露醇脱氢酶的制备方法。
[0008]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种异麦芽酮糖醇的制备方法。
[0009]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种产品。
[0010]本专利技术所采取的技术方案是：
[0011]本专利技术的第一方面，提供甘露醇脱氢酶或其相关生物材料在(a1)～(a2)至少一种
中的应用：
[0012](a1)生产异麦芽酮糖醇；
[0013](a2)制备生产异麦芽酮糖醇的产品；
[0014]所述甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015]优选地，所述相关生物材料为下述(b1)～(b8)中的任一种；
[0016](b1)编码所述甘露醇脱氢酶的核酸分子；
[0017](b2)含有(b1)所述核酸分子的表达盒；
[0018](b3)含有(b1)所述核酸分子的重组载体；
[0019](b4)含有(b2)所述表达盒的重组载体；
[0020](b5)含有(b1)所述核酸分子的重组细胞；
[0021](b6)含有(b2)所述表达盒的重组细胞；
[0022](b7)含有(b3)所述重组载体的重组细胞；
[0023](b8)含有(b4)所述重组载体的重组细胞。
[0024]优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0025]优选地，所述载体包括但不限于质粒载体。
[0026]优选地，所述质粒载体包括pMA5载体、pHT43载体、pET
‑
28a载体、pMJ19载体或pDXW
‑
10载体中的至少一种。
[0027]优选地，所述重组载体通过将载体与所述的用于编码甘露醇脱氢酶的基因经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后连接获得的。
[0028]优选地，所述重组细胞非动物或植物新品种。
[0029]优选地，所述细胞包括原核细胞或真核细胞。
[0030]优选地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、链霉菌等中的至少一种。
[0031]优选地，所述真核细胞包括酵母细胞。
[0032]优选地，所述酵母细胞包括毕赤酵母、酿酒酵母等中的至少一种。
[0033]本专利技术的第二方面，提供了一种甘露醇脱氢酶的制备方法，通过培养本专利技术第一方面所述的重组细胞获得甘露醇脱氢酶。
[0034]优选地，所述培养基可为LB培养基、TB培养基或NB培养基。
[0035]优选地，所述LB液体培养基包括：蛋白胨8～12g/L、酵母膏4～6g/L、NaCl 8～12g/L。
[0036]优选地，所述LB固体固体培养基还包括1～3g/L琼脂粉。
[0037]优选地，所述培养的温度为20
‑
40℃；和/或，时间为18
‑
30h；和/或，转速为150
‑
210rpm。
[0038]本专利技术的第三方面，提供一种异麦芽酮糖醇的制备方法，包括将本专利技术第一方面所述的重组细胞加入含有异麦芽酮糖的反应体系中进行转化反应。
[0039]优选地，所述方法具体包括使用含有异麦芽酮糖的缓冲液重悬上述细胞至细胞在缓冲液中的细胞浓度为OD600＝15
‑
30，得到反应体系。
[0040]优选地，所述转化反应的培养基的配方包括但不限于：葡萄糖10～30g/L、蛋白胨8～12g/L、NaH2PO
4 0.5～1g/L、Na2HPO
4 12H2O 1～1.5g/L、MgSO4·
7H2O 0.5～1.5g/L，pH为7
～7.5。
[0041]优选地，所述转化的温度为25
‑
40℃。
[0042]优选地，所述转化的pH为6
‑
7.5。
[0043]优选地，所述转化的时间为150～210rpm转化20
‑
30h。
[0044]优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液但并不局限于此。
[0045]优选地，所述异麦芽酮糖在反应体系中的浓度为50
‑
200g/L。
[0046]本专利技术的第四方面，提供一种产品，所述产品包含本专利技术第一方面所述的甘露醇脱氢酶或相关生物材料。
[0047]优选地，所述产品还包括异麦芽酮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甘露醇脱氢酶或其相关生物材料在(a1)～(a2)至少一种中的应用：(a1)生产异麦芽酮糖醇；(a2)制备生产异麦芽酮糖醇的产品；所述甘露醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述相关生物材料为下述(b1)～(b8)中的任一种；(b1)编码权利要求1所述甘露醇脱氢酶的核酸分子；(b2)含有(b1)所述核酸分子的表达盒；(b3)含有(b1)所述核酸分子的重组载体；(b4)含有(b2)所述表达盒的重组载体；(b5)含有(b1)所述核酸分子的重组细胞；(b6)含有(b2)所述表达盒的重组细胞；(b7)含有(b3)所述重组载体的重组细胞；(b8)含有(b4)所述重组载体的重组细胞。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述细胞包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、链霉菌、毕赤酵母、酿酒酵母中的至少一种。4.一种合成甘露醇脱氢酶的的制备方法，其特征在于，通过培养权利要求2所述的重组细胞获得甘露醇脱氢酶。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度为20
‑
40℃；和/或，时间为18

【专利技术属性】
技术研发人员：苏慧慧，杨占东，黄俊生，胡双岚，张平军，郭艺山，
申请(专利权)人：广东省科学院生物与医学工程研究所，
类型：发明
国别省市：