泛素偶联酶UBE2O在医学中的应用制造技术

本发明专利技术公开了泛素偶联酶UBE2O在促进红细胞KLF1的单泛素化中的应用。本发明专利技术的研究显示UBE2O促进KLF1的单泛素化。UBE2O单泛素KLF1可能会影响其定位或活性，进而影响KLF1与被其调控的基因启动子的相互作用，从而抑制红细胞生成的顺利进行。至此，我们阐明UBE2O单泛素化KLF1进而抑制红细胞生成的分子机制。这些结果的获得将为筛选以调节UBE2O活性并影响红细胞生成效率的小分子化合物提供理论基础，将为提高体外红细胞分化效率提供可能的化合物，为红细胞异常相关导致的疾病提供新的治疗选择。细胞异常相关导致的疾病提供新的治疗选择。

【技术实现步骤摘要】
泛素偶联酶UBE2O在医学中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及泛素偶联酶UBE2O在医学中的应用。

技术介绍

[0002]2017年，英国医学研究委员会分子生物学实验室的研究人员鉴定出一种蛋白质量控制通路在人体中大量存在的一些蛋白复合体
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血红蛋白和核糖体
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中发挥着作用。他们证实这个过程中的一个关键组分是一种保守的被称作UBE2O的泛素偶联酶，它识别底物，对这些底物进行标记以便被蛋白酶体降解。研究人员利用一种引入三个碱性氨基酸残基(three basic residues,3R)的跨膜结构域和不含细胞的细胞质提取物，研究哪些质量控制因子识别3R，结果发现在不存在一种独立的泛素连接酶的情形下，一种保守的被称作UBE2O的泛素偶联酶直接识别未组装的蛋白上的并列分布的碱性氨基酸小片段(basic patch)和疏水性氨基酸小片段(hydrophobic patch)来介导泛素化。
[0003]研发还发现，与其他的质量控制通路往往利用不同的因子(经常是分子伴侣)进行靶标选择、泛素提供和泛素偶联。将所有这三种活性编码在单个蛋白(即UBE2O)中为开展详细的机制分析和结构分析提供一种易处理的途径。这意味着是UBE2O是一种具有泛素偶联酶(E2)和泛素连接酶(E3)活性的杂合酶。
[0004]在网织红细胞中，UBE2O能高度上调表达，并且UBE2O对未与β
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珠蛋白组装在一起的α
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珠蛋白进行选择性泛素化。在非红系细胞中，不与核输入因子结合在一起的核糖体蛋白也是UBE2O的靶标，即也是UBE2O的底物。
[0005]由上可知，UBE2O是一种独立的质量控制因子，具有底物识别和泛素转移活性，能够高效地靶向多蛋白复合体中的孤儿蛋白以便被蛋白酶体降解。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供泛素偶联酶的在医学中的应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术的第一个方面，是提供泛素偶联酶UBE2O在促进红细胞KLF1单泛素化中的应用。
[0009]本专利技术的第二个方面，是提供一种抑制红细胞生成的方法，包括加入促进剂使泛素偶联酶UBE2O促进KLF1的单泛素化。
[0010]本专利技术的第三个方面，是提供一种促进红细胞生成的方法，包括加入抑制剂，使泛素偶联酶UBE2O不能促进KLF1的单泛素化。
[0011]本专利技术的第四个方面，是提供一种治疗红细胞异常疾病的药物，所述药物具有使泛素偶联酶UBE2O不能促进KLF1的单泛素化的作用，或所述药物具有抑制泛素偶联酶UBE2O表达的作用。
[0012]本专利技术的第五个方面，是提供一种检测红细胞异常的试剂盒，包括有检测泛素偶联酶UBE2O促进红细胞KLF1的单泛素化的试剂。
[0013]本专利技术的专利技术人以鼠红白血病细胞(MEL)为细胞模型，在红细胞生成的早期UBE2O的mRNA与蛋白表达水平均显著上升，提示UBE2O可能参与调节红细胞生成的进程。蛋白质组学的分析验证了我们的假设，过表达野生型UBE2O抑制红细胞相关蛋白的表达，而失去E2结合酶活性的UBE2O则不具有这种抑制能力。通过亲和纯化蛋白质谱，我们发现UBE2O与红细胞生成密切相关的重要转录因子KLF1相互作用。进一步的研究显示UBE2O促进KLF1的单泛素化。UBE2O单泛素KLF1可能会影响其定位或活性，进而影响KLF1与被其调控的基因启动子的相互作用，从而抑制红细胞生成的顺利进行。至此，我们阐明UBE2O单泛素化KLF1进而抑制红细胞生成的分子机制。这些结果的获得将为筛选以调节UBE2O活性并影响红细胞生成效率的小分子化合物提供理论基础，将为提高体外红细胞分化效率提供可能的化合物，为红细胞异常相关导致的疾病提供新的治疗选择。
附图说明
[0014]图1为UBE2O抑制红细胞分化过程中红细胞相关蛋白表达的能力依赖于其E2结合酶活性的结果示意图。
[0015]图2为UBE2O与KLF1的DNA结合结构域相互作用的结果示意图。
[0016]图3为UBE2O单泛素化KLF1的结果示意图。
具体实施方式
[0017]本专利技术下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0018]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。
[0019]下面结合具体实施例子对本专利技术进行详细说明。以下实施例子将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术。
[0020]实施例1：UBE2O抑制红细胞分化过程中红细胞相关蛋白表达的能力依赖于其E2结合酶活性
[0021]为了验证UBE2O是否参与调节红细胞生成，我们在MEL细胞中利用慢病毒系统稳定过表达UBE2O(野生型WT与E2失活突变体CS)。
[0022]实验步骤：
[0023]试剂及材料准备
[0024]1.离心机
[0025]2. 10/30kDa截留柱；
[0026]3. 1mL UA buffer每个样本
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8M尿素,0.1M Tris pH 8.5(裂解液中加入10mM DTT)；
[0027]4. 110μL IAA buffer每个样本
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溶解0.05M Iodoacetamide in UA Buffer中；
[0028]5. 400μL ABC Buffer
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50mM Ammonium Bicarbonate(20mg溶解到5mL H2O)
[0029]细胞样品制备。
[0030]1.取6孔板一个孔或6cm皿的细胞量，细胞沉淀大于10μL即可。PBS洗一遍，去净上
清，加入10倍沉淀体积的Lysis buffer(不含DTT)，室温裂解10min。(如果有较多粘性不溶物，1:5000加入核酸酶，垂直混匀20min至无明显不溶物，常温离心机最大转速离心10min)；
[0031]2.移出上清到新的EP管，取5
‑
15μL稀释5倍后BCA定量。每个样品取50μg蛋白，加入2μL的1M DTT，用Lysis buffer补至200μL后用于上柱子。
[0032]3.测试10/30kDa截留柱：
[0033]加入50μL UA buffer
[0034]1)1000rpm，20℃离心30s
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仅有一滴液体流下；
[0035]2)11000rpm，20℃离心5min
–
截留柱中仍有液体残留；
[0036]3)11000rpm，20℃离心10min
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液体全部流下；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.泛素偶联酶UBE2O在促进红细胞KLF1单泛素化中的应用。2.一种抑制红细胞生成的方法，其特征在于，包括加入促进剂使泛素偶联酶UBE2O促进KLF1单泛素化。3.一种促进红细胞生成的方法，其特征在于，包括加入抑制剂，使泛素偶联酶UBE2O不能促进KLF1单泛素化。4.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小飞，黄秋玲，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：