一种适用于碱性制造技术

本发明专利技术涉及酶催化技术领域，尤其是一种适用于碱性

【技术实现步骤摘要】
一种适用于碱性pH的NADH焦磷酸酶及其应用


[0001]本专利技术涉及酶催化
，具体领域为一种适用于碱性
pH
的
NADH
焦磷酸酶及其应用
。

技术介绍

[0002]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
(NAD+)
及其还原形式
(NADH)
是体内无处不在的分子，在能量代谢中起着至关重要的作用，因为它们在线粒体氧化磷酸化过程中充当氢化物接受和氢化物供体辅酶
。
除了作为氧化还原辅助因子的作用外，在过去十年中，
NAD+
已被发现是许多蛋白质家族的关键底物，通过其下游作用，这些蛋白质参与
500
多种酶促反应并调节细胞中几乎所有主要的生物过程
.NAD+
的这种连续酶促利用通过膳食色氨酸的从头合成或通过其从前体中回收来抵消
。
通过施用
NAD+
前体
NMN
补充
NAD+
已被证明可有效改善老年小鼠缺血
IR
损伤和肾毒性药物引起的肾小管损伤
。
这些结果使人们注意到使用
NAD+
前体对抗人类代谢疾病
。
[0003]关于这种分子在细胞中的作用的信息非常稀少
。
事实上，只有一种酶活性被描述用于产生
NMNH。
据推测，在细胞中，
NMNH
将通过烟酰胺单核苷酸腺苷酸转移酶
(NMNATs)
>转化为
NADH。
然而，
Nudix
二磷酸酶的
NMNH
产生和
NMNATs
用于
NADH
合成仅在体外使用分离的蛋白质进行了描述，以及
NMNH
如何参与细胞
NAD+
代谢仍然未知
。
[0004]有研究人员探索了
NMNH
给药在小鼠中的体内效应，并证明这种新的前体有效地提高了血液和各种组织中的
NAD+
水平，包括肾脏，在相同浓度下使用时比
NMN
更大
。
[0005]这些结果证实，
NMNH
做为还原的
NAD+
前体可以作为非常有效的
NAD+
增强子，并为新一代高效的
NAD+
增强分子的发现提供了新的思路
。
[0006]还原型烟酰胺单核苷酸
(NMNH)
虽然吸收效果优于
NMN
，但其水溶液稳定性很差，在常温中性
pH
时极易降解，并随时间的延长进一步加剧，对规模生产造成较大的障碍
。
为解决此问题，有两种方案值得尝试：一个是提升酶活
、
缩短总反应时间，以减少
NMNH
的降解发生时间，反应结束尽快进行提取流程；另一个是提升总反应体系的
pH
值，使
NMNH
的稳定性增强，减缓在反应过程中降解程度
。
而第二种方案可以通过筛选耐碱微生物来源的蛋白
、
点突变提升酶的耐碱性而实现，对于酸性条件易降解的产物，筛选耐碱突变体并将最佳反应条件调整至碱性，对于反应的进行
、
产物的保护以及后续分离提取都将带来积极的效果
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种适用于碱性
pH
的
NADH
焦磷酸酶及其应用
。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一种适用于碱性
pH
的
NADH
焦磷酸酶，其氨基酸序列如
SEQ ID NO
：1所示
。
[0010]本专利技术的适用于碱性
pH
的
NADH
焦磷酸酶可用于催化
NADH
，其使用方法为：取
NADH
干粉，加入
MgCl2、MnCl2和
Tris
‑
HCl
，
pH
为
7.5
～
10.0
，加入
NADH
焦磷酸酶的粗酶液，
30℃
反应
。
[0011]其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
[0012](1)
通过引物拼接的方法，将
SEQ ID NO
：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
[0013](2)
采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
[0014]①
摇瓶发酵
[0015]挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于
10mL
高压灭菌后的培养基
A
中，
30℃
，
250rpm
过夜培养；
[0016]次日取
1L
三角瓶，按1：
100
的接种比例接入到
100mL
高压灭菌后的培养基
B
中，于
30℃
中培养至菌体
OD 5
‑6，立刻将三角瓶置于
25℃
摇床中，
250rpm
培养1小时
。
加
IPTG
至终浓度
0.1mM
，并于
25℃
，
250rpm
继续培养
16
小时；
[0017]培养结束后，将培养液于
4℃
，
12000g
下离心
20
分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，
‑
70℃
保存；同时取少量菌体进行
SDS
‑
PAGE
检测；
[0018]②
分批补料发酵
[0019]分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备
200ml
种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为
OD2.0
时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持
37℃
，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在
30
％，而培养基的
pH
值由
50
％
v/v
正磷酸和
30
％
v/v
氨水维持在
7.0
；发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％
w/v
蛋白胨
、9
％
w/v
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种适用于碱性
pH
的
NADH
焦磷酸酶，其特征在于：其氨基酸序列如
SEQ ID NO
：1所示
。2.
权利要求1所述适用于碱性
pH
的
NADH
焦磷酸酶在催化
NADH
中的应用
。3.
根据权利要求2所述适用于碱性
pH
的
NADH
焦磷酸酶在催化
NADH
中的应用，其特征在于：取
NADH
干粉，加入
MgCl2、MnCl2和
Tris
‑
HCl
，
pH
为
7.5
～
10.0
，加入
NADH
焦磷酸酶的粗酶液，
30℃
反应
。4.
根据权利要求3所述适用于碱性
pH
的
NADH
焦磷酸酶在催化
NADH
中的应用，其特征在于，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
(1)
通过引物拼接的方法，将
SEQ ID NO
：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
(2)
采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
①
摇瓶发酵挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于
10mL
高压灭菌后的培养基
A
中，
30℃
，
250rpm
过夜培养；所述培养基
A
为：胰蛋白胨
10g/L
，酵母提取物
5g/L
，磷酸氢二钠
3.55g/L
，磷酸二氢钾
3.4g/L
，氯化铵
2.68g/L
，硫酸钠
0.71g/L
，七水硫酸镁
0.493g/L
，六水氯化铁
0.027g/L
，甘油
5g/L
，葡萄糖
0.8g/L
，添加卡那霉素至
50mg/L
；次日取
1L
三角瓶，按1：
100
的接种比例接入到
100mL
高压灭菌后的培养基
B
中，于
30℃
中培养至菌体
OD 5
‑6，立刻将三角瓶置于
25℃
摇床中，
250rpm
培养1小时；加
IPTG
至终浓度
0.1mM
，并于
25℃<...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，钱明，靳思雨，高顾杰，彭朋，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：