卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来自卵菌的液泡型ATPase亚基a蛋白VHA

【技术实现步骤摘要】
卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白及其编码基因与应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种病原卵菌质子泵蛋白及其编码基因与应用，特别涉及来自卵菌中液泡型ATPase亚基a蛋白VHA
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a其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]卵菌是一类真核生物，包括辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、大豆疫霉(Phytophthora sojae)、荔枝霜疫霉(Phytophthoralitchii)、终极腐霉(Pythium ultimum)等植物病原卵菌，寄主范围广泛，可以侵染大多数的双子叶植物。大豆疫霉对大豆造成严重危害，可以引起大豆的种腐、苗枯、根腐以及茎基腐。荔枝霜疫霉可造成荔枝大量的烂果、落果，春雨、梅雨季较长的年份，烂果率达30
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50％，严重影响产量和品质以及鲜果的贮运。终极腐霉可侵染苹果、草莓、柑橘、西瓜、甘蔗、番茄等150余种经济植物，引起苗枯，猝倒、根腐、脚腐、枯萎等多种病害。卵菌病害给农业和自然生态系统造成严重破坏。
[0003]液泡型ATPase蛋白是一个依赖于ATP的质子泵，可以将细胞质H
+
泵入细胞内室。液泡型ATPase蛋白广泛分布在真核细胞的细胞膜系统中，包括各种细胞的内体、溶酶体、高尔基体小泡、分泌小泡和细胞膜。液泡型ATPase亚基a蛋白是V
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ATPase的一个重要亚基，该蛋白在卵菌和大部分真菌中只有一个拷贝。因此，通过抑制卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白，进而抑制各个阶段的卵菌的生长，可以达到控制辣椒疫病的目的。

技术实现思路

[0004]基于此，通过专利技术人的研究发现，包括大豆疫霉、辣椒疫霉、荔枝霜疫霉、终极腐霉等卵菌中液泡型ATPase亚基a蛋白纯合敲除致死，该亚基是卵菌正常生长必不可少的亚基。对卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白杂合转化子进行生物学表型测定，除孢子囊和游动孢子个数显著高于亲本菌株外，其他无显著变化，表明亚基a蛋白杂合敲除对表型影响较小。因此可通过调控液泡型ATPase亚基a蛋白来抑制卵菌的正常生长，从而控制卵菌病害的发生发生发展。
[0005]因此，本专利技术的目的之一是提供一类卵菌液泡型ATPase亚基a蛋白，分别来源于大豆疫霉、辣椒疫霉、荔枝霜疫霉和终极腐霉，命名为PcVHA
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a、PsVHA
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a、PlVHA
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a、PyuVHA
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a，分别来源于辣椒疫霉菌株BYA5、大豆疫霉P6497、荔枝霜疫霉Plyn3、终极腐霉Pyuyn7，是如下A1)或A2)或A3)或A4)
[0006]A1)氨基酸序列是如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白质；
[0007]A2)在如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0008]A3)将如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白衍生的蛋白质；
[0009]A4)与如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列相似性在75％以上，优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
[0010]为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在如序列表中SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上Poly
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Arg(RRRRR)、Poly
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His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep
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tag II(WSHPQFEK)、c
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myc(EQKLISEEDL)等标签。
[0011]上述A1)
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A4)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)
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A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5
’
端和/或3
’
端连上述标签的编码序列得到。
[0012]其中，SEQ ID No.5所示蛋白PcVHA
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a，其编码基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，来源于辣椒疫霉；SEQ ID No.6所示蛋白PsVHA
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a，其编码基因为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，来源于大豆疫霉；SEQ ID No.7所示蛋白PlVHA
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a，其编码基因为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，来源于荔枝霜疫霉；SEQ ID No.8所示蛋白PyuVHA
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a，其编码基因为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，来源于终极腐霉。
[0013]本专利技术目的之二是提供编码所述VHA
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a蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0014]其中，上述PcVHA
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a的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
[0015]B1)序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
[0016]B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码上述VHA
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a的cDNA分子或DNA分子；
[0017]B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述PcVHA
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a、PsVHA
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a、PlVHA
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a、PyuVHA
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a的cDNA分子或DNA分子。
[0018]上述编码基因，序列表中SEQ ID NO.1由2616个核苷酸组成，自序列1的5
’
端第1至第2616位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.5所示的蛋白质(PcVHA
‑
a)；序列表中SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种液泡型ATPase亚基a蛋白，是如下A1)或A2)或A3)或A4)的蛋白质：A1)由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2)在如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；A3)由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与卵菌敲除致死相关的由A1)衍生的蛋白质；A4)与SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列相似性在93％以上，优选在95％以上，更优选在98％以上且具有与如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所示的液泡型ATPase亚基a蛋白的编码基因；优选的，所述编码基因为如下B1)或B2)或B3)：B1)SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所述的核苷酸序列所示的DNA分子；B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有75％以上或85％以上或95％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；B3)在严格条件下与B1)或B3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。3.权利要求2所述的编码基因转录得到的RNA分子；优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：C1)如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；C2)如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示的DNA序列转录的RNA序列。4.与权利要求1所示的液泡型ATPase亚基a蛋白、权利要求2所示的编码基因或权利要求3所述的RNA分子相关的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：D1)含有权利要求2所述编码基因的表达盒；D2)含有权利要求2所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；D3)含有权利要求2所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；D4)含有权利要求2所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；D5)含有权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘西莉，苗建强，代探，彭钦，黄中乔，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：