本发明专利技术公开了一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于免疫技术领域。本发明专利技术利用重组PCR法制备得到SIV gag与肠道病毒EV71型VP1基因的融合基因gag-VP1，并证实该融合基因能够在体外有效表达。利用SIV gag能够自我组装成病毒样颗粒的特性，首次利用gag-VP1杆状病毒制备了gag-VP1病毒样颗粒。本发明专利技术利用杆状病毒表达系统制备含有gag与肠道病毒EV71 VP1融合基因的病毒样颗粒，制备过程简便，易纯化，产量相对较大，有望为新型手足口病疫苗的研发奠定实验室基础。
【技术实现步骤摘要】
重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗 粒及其制备方法和应用
本专利技术属于免疫
，涉及一种病毒样颗粒及其制备方法，具体涉及肠道病 毒EV71型VPl基因病毒样颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
手足口病（Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)是由一组肠道病毒引起的常见 传染性疾病，发病人群主要为5岁以下儿童，该病传染性强，传播途径复杂，在短时间内即 可造成大流行，近年来在我国持续爆发，严重危害公众健康并带来巨大社会负担。因此，应 用新的技术手段及策略，研发安全性高、免疫保护性强并利于产业化生产的新型手足口病 疫苗具有重要的理论及实际应用意义。 引发手足口病的肠道病毒包括肠道病毒71型、A组柯萨奇病毒和埃可病毒等，其 中肠道病毒 71 型（Enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒 A16 型（Coxsackievirus, CA16) 为主要致病病毒。肠道病毒71型（EV71)属于小RNA病毒科（Picornaradae)的肠道病毒 属（Enterovirus),归属于人类肠道病毒A。该病毒为二十面体立体对称的球形结构，无包 膜和突出，直径约24?30nm，核酸为单股正链RNA。在病毒复制过程中，病毒RNA首先翻译 出一条完整长肽，进而被自身蛋白酶识别并切割为PI、P2、P3等3条多肽；其中Pl被再次 酶解为VP4、VP2、VP3及VPl等4个结构蛋白；P2多肽被切割为2A、2B及2C等3条多肽；P3 多肽被切割为3A、VPg、3C、3D等4条多肽。结构蛋白VP1、VP2、VP3及VP4构成原聚体，进而 再拼装成具有五聚体结构的亚单位，后者通过各自的结构域相互连接，最终由60个亚单位 形成病毒的外壳。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外 壳的内侧与病毒核心紧密连接，研究表明，EV71病毒抗原表位基本位于壳蛋白VPl、VP2上， 而VPl具有最多的特异性中和位点，因此成为研究的热点。 病毒样颗粒（Virus Like Particles, VLPs)是利用病毒的结构蛋白可在细胞内自 行装配成一个不含核酸成分的病毒粒子的特性开发的一种新的疫苗研发技术平台。病毒样 颗粒具有众多优点：①不具有感染性及核酸整合致病性，相对灭活减毒疫苗其安全性得到 了保障；②VLPs保持了病毒蛋白空间结构，可通过和病毒感染相似的途径将抗原呈递给免 疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护应答；③VLPs易规模化生产，可满足临床应 用需要。目前常用的病毒结构蛋白有HBVs，HPV，SIV gag蛋白，HIV gag蛋白，Ebola病毒GP 蛋白等。SIV gag基因编码的蛋白可被蛋白水解酶裂解成3个结构蛋白，分别为基质（MA)、 衣壳蛋白（CA)及核衣壳蛋白（NC)，可自我装配成核心颗粒，以出芽方式分泌到细胞外时获 得包膜及膜蛋白。研究表明，gag的C端与多肽或外源性基因融合不影响gag自我组装成 VLPs的特性，而目前研究表明其它病毒的结构蛋白不具备此特性。 目前，用于制备病毒样颗粒的平台有：酵母表达系统，植物表达系统，哺乳动物表 达系统，杆状病毒表达系统等。利用重组杆状病毒表达系统制备病毒样颗粒，由于安全性 高，产量大因而备受关注。重组杆状病毒表达系统制备的VLPs又分为细胞内VLPs及分泌 型VLPs，细胞内VLPs因组装成的VLPs位于细胞内，限制了表达量，且纯化过程相对繁琐。 Chung等在细胞中共表达EV71病毒Pl和3⑶区并组装成VLPs，通过裂解细胞获得疫苗，但 该方法获得的VLPs相对分泌型产量较低，制备流程繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以SIV gag结构蛋白为基础重组SIV gag与肠道病毒 EV71型VPl融合基因的病毒样颗粒及其制备方法和应用，该方法制备过程简便，易纯化，结 构均一，产量大，经本方法制得的gag-VPl病毒样颗粒具有良好的免疫效果。 本专利技术是通过以下技术方案来实现： -种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VPl融合基因的病毒样颗粒，该病毒样颗粒 是将融合基因 gag-VPl克隆到真核表达载体及杆状病毒转座载体中分别得到真核表达载 体和重组转座载体，然后真核表达载体转染哺乳动物细胞，重组转座载体转化DHlOBac感 受态细胞制得重组杆粒，将重组杆粒转染TN5昆虫细胞，经分泌表达制得； 其中，所述融合基因 gag-VPl是以重叠 PCR法获得的SIV gag与EV71 VPl的融合 基因，且融合基因 gag-VPl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。 融合基因 gag-VPl 大小为 2458bp，91kDa。 所述真核表达载体为pCAGGs，融合基因 gag-VPl克隆到pCAGGs载体所形成的的重 组质粒为 gag-VPl-pCAGGs。 所述的杆状病毒转座载体为pFastBac?l，融合基因 gag-VPl克隆到pFastBac?l 所形成的重组转座载体为gag-VPl_pFastBac?l。 一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VPl融合基因的病毒样颗粒的制备方法，包 括以下步骤： 1)采用重叠 PCR法制得融合基因 gag-VPl，将融合基因 gag-VPl克隆入杆状病毒 转座载体pFastBac?l中，得到重组转座载体gag-VPl_pFastBac?l ; 2)将重组转座载体gag-VPl-pFastBac?l转化DHlOBac感受态细胞，然后与 Bacmid进行重组，经鉴定，得到重组杆粒gag-VPI-Bacmid ; 3)将重组杆粒8&8-￥?1-8&〇1^(1转染了阳昆虫细胞，直至细胞病变率超过80% 后，离心收集上清，得到Pl代病毒，将Pl代病毒连续传代2次后，得到重组杆状病毒rBV gag-VPl ； 4)将重组杆状病毒rBV gag-VPl以MOI为5接种TN5细胞，经悬浮培养后离心收 集上清，经纯化制得重组SIV gag与肠道病毒EV71型VPl融合基因的病毒样颗粒。 步骤1)是将融合基因 gag-VPl克隆入杆状病毒转座载体pFastBac?l的EcoRI、 NotI酶切位点之间，得到重组转座载体gag-VPl-pFastBac?l。 步骤4)是在28°C下悬浮培养72h后离心收集上清。 步骤4)所述的纯化具体操作为： 首先，将得到的上清经GE Quixstand系统超滤纯化，在4°C下进行浓缩； 然后，将浓缩产物经15%?50%的不连续蔗糖密度梯度，再在28000r/min、4°C的 条件下超高速离心2h，收集不同浓度的蔗糖组分； 最后，用PBS洗涤，再经28000r/min超高速离心30min，沉淀经PBS重悬，得到纯化 后的重组SIV gag与肠道病毒EV71型VPl融合基因的病毒样颗粒。 重组SIV gag与肠道病毒EV71型VPl融合基因的病毒样颗粒在制备治疗手足口 病的疫苗中的应用。 所述的疫苗为抗EV71病毒感染的疫苗。 与现有技术相比，本专利技术具有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将融合基因gag‑VP1克隆到真核表达载体及杆状病毒转座载体中分别得到真核表达载体和重组转座载体，然后真核表达载体转染哺乳动物细胞，重组转座载体转化DH10Bac感受态细胞制得重组杆粒，将重组杆粒转染TN5昆虫细胞，经分泌表达制得；其中，所述融合基因gag‑VP1是以重叠PCR法获得的SIV gag与EV71 VP1的融合基因，且融合基因gag‑VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
【技术特征摘要】
1. 一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒，其特征在于，该 病毒样颗粒是将融合基因gag-VPl克隆到真核表达载体及杆状病毒转座载体中分别得到 真核表达载体和重组转座载体，然后真核表达载体转染哺乳动物细胞，重组转座载体转化 DHlOBac感受态细胞制得重组杆粒，将重组杆粒转染TN5昆虫细胞，经分泌表达制得； 其中，所述融合基因gag-VPl是以重叠PCR法获得的SIV gag与EV71 VP1的融合基因， 且融合基因gag-VPl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒 样颗粒，其特征在于，融合基因gag-VPl大小为2458bp、91kDa。3. 根据权利要求1所述的一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒 样颗粒，其特征在于，所述真核表达载体为pCAGGs，融合基因gag-VPl克隆到pCAGGs载体所 形成的的重组质粒为gag-VPl-pCAGGs。4. 根据权利要求1所述的一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒 样颗粒，其特征在于，所述的杆状病毒转座载体为pFastBacTMl，融合基因gag-VPl克隆到 pFastBac?l所形成的重组转座载体为gag-VPl_pFastBac?l。5. -种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒的制备方法，其特 征在于，包括以下步骤： 1) 采用重叠PCR法制得融合基因gag-VPl，将融合基因gag-VPl克隆入杆状病毒转座 载体pFastBac?l中，得到重组转座载体gag-VPl_pFastBac?l ; 2) 将重组转座载体gag-VPl-pFastBac?l转化DHlOBac感受态细胞，与Bacmid进行重 组，经鉴定，得到重组杆粒ga...
【专利技术属性】
技术研发人员：张惠中，王希，林芳，董轲，高萍，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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