一种分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法技术

一种分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，涉及利用双向电泳技术在金山绣线菊中分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法。通过该技术分离纯化此酶，比传统的柱层析等方法具有更高的精确性、可操作性和先进性。方法：一、金山绣线菊梯度低温处理；二、金山绣线菊叶片蛋白提取；三、蛋白定量与纯化；四、第一向固相PH梯度等电聚焦电泳；五、第二向SDS-PAGE凝胶电泳；六、凝胶平衡与染色；七、凝胶扫描和图像分析；八、目标蛋白酶解与脱水；九、目标蛋白重结晶与纯化，完成分离纯化过程。用该方法使提取的蛋白酶具更高纯度、更多数量和更优科研价值，此方法提取纯化蛋白酶可用于酶活性、氧化还原与清除氧自由基机理、抗逆机制、抗逆基因克隆、蛋白组学等研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种由双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法。
技术介绍
硫酸铵分级沉淀和柱层析法是传统的分离谷胱甘肽过氧化物酶的方法，硫酸铵沉淀法的原理是高浓度的硫酸铵离子在蛋白溶液中与蛋白竞争水分子，从而破坏蛋白表面的水化膜，降低其溶解度并使之从溶液中沉淀出来，因此可利用不同浓度的硫酸铵溶液沉淀溶解度不同的蛋白；柱层析法的原理是蛋白样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次分配后可将不同蛋白分离。这2项技术原理简单但实验过程繁琐复杂，不仅需要专门的实验设备和仪器，且分离蛋白时间超长，不能实现蛋白纯化和蛋白批量化，因此有待探索新的实验技术和方法。Farrell于1975年首次建立了等电聚焦一聚丙稀酰胺双向凝胶分离和分析蛋白质组的技术，并使用该技术成功分离了约1000个蛋白质。这就是后来的二维双向凝胶电泳技术(Two-dimens1nal gelelectrophoresis)，并于20世纪70年代初广泛应用，随着该技术的不断成熟和完善，其分离蛋白质的精度和特异性越来越高。操作二维双向凝胶电泳时首先进行等电聚焦，使待分离的各个蛋白按各自的PH梯度分离，至各自的等电点处，再沿垂直方向按蛋白质分子量的不同进行分离。双向凝胶电泳技术因其原理简明，操作简单，分离精准，能批量分离并纯化蛋白等特点已能够应用于分离蛋白质组中所有蛋白，如结合质谱鉴定技术，还能实现蛋白质鉴定等诸多功能。酶蛋白是蛋白家族中种类最为丰富的一类蛋白，利用二维双向电泳技术也可以实现酶蛋白精确的分离和纯化，谷胱甘肽过氧化物酶是一类参与逆境调解的酶蛋白，是植物体内清除活性氧的重要酶类，能保护生物膜、蛋白质免受活性氧损伤，并具有提高植物抗性的生理功能。因此如能从众多酶蛋白中单独分离提纯出谷胱甘肽过氧化物酶，就可进一步用于该酶的活性研究、氧化还原与清除氧自由基机理研究、抗逆机制研究、抗逆基因克隆、差异蛋白质组学的相关研究等。因此本专利技术利用二维双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶。利用二维双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶，和传统的分离技术相比，双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶过程中，经过二次电泳后可将该酶蛋白充分分离，提高了蛋白分离的效率和精准度；双向电泳技术还可实现平行泳道多次加样和平行样品重复实验，因此能一次性得到一定数量的纯化酶蛋白，可为其他科学实验提供充足的酶蛋白样品；该方法在实验过程中共经过了 3次纯化蛋白的操作，保证了所分离的酶蛋白的高纯度，可用于对酶蛋白的质量和纯度要求很高的底物与蛋白互作等高层次的科学研究，这是传统的蛋白分离技术所无法比拟和实现的。
技术实现思路
本专利技术提供在金山绣线菊中分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，利用二维双向凝胶电泳技术，通过凝胶扫描和图像分析、胶内蛋白酶解等技术，建立在金山绣线菊中分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的技术体系，与传统的提取该酶蛋白的方法相比，利用双向电泳技术与方法分离纯化蛋白具有更高的精确性、可操作性和先进性；该技术方法分离纯化的蛋白具有更高的纯度、更多的数量和更优的科研价值。由二维双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，按以下步骤进行:—、金山绣线菊梯度低温处理；二、金山绣线菊叶片蛋白质的提取:液氮充分研磨金山绣线菊叶片，加入蛋白提取试剂I，-20°C静置过夜。低温过夜后提取液4°C离心2小时留取沉淀，用含0.07% β -巯基乙醇约3倍沉淀体积的冷丙酮重悬沉淀后，在鼓风干燥装置中抽干沉淀。按30 μ 1/mg比例加入蛋白提取试剂II，冰浴后4°C离心I小时留取上清液。三、蛋白质定量与纯化:采用标准曲线法进行蛋白定量，按照2D-Quant试剂盒说明进行蛋白纯化，纯化后的蛋白样品保存于-80°C冰箱中待用。四、第一相固相PH梯度等电聚焦电泳:取蛋白样品溶液均匀滴加并充满胶条槽底部，将胶条轻覆于液层上，在IPGphor电泳仪上进行等电聚焦，聚焦电泳后将胶条分别放入平衡液A、平衡液B中平衡15min，再用双蒸水充分润洗沥干后进行第二相电泳。五、第二相SDS-PAGE凝胶电泳:按常规制胶方法灌制凝胶，之后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。六、凝胶平衡与染色:待电泳结束，蛋白充分分离后取出凝胶，放入固定液中固定，再将凝胶转移至热考染液中染色10分钟，蛋白斑点清晰染色后，凝胶放入乙酸液中脱色，脱色至凝胶背景呈无色状态。七、凝胶扫描和图像分析:用UMAX扫描仪扫描染色的聚丙烯酰胺凝胶并获取电子图像，利用专业分析软件2-DImagemaster ElitTM分析凝胶图像，给出各个染色蛋白点的实际分子量和等电点。八、目标蛋白胶内酶解与脱水:在凝胶上准确切取分子量为19.095KDa、PI值为8.98的蛋白点(目标蛋白)，在切取的胶团中加入4-5 μ I含5ng/ μ I胰蛋白酶的25mM适量碳酸氢铵溶液，使胶团完全吸涨并酶解12-14小时。将蛋白酶解体系放入60 μ I的50%乙晴液中脱水45分钟，再向乙腈液中加入16-18 μ 10.5%的适量TFA，将蛋白脱水体系放在4°C摇床上振荡三小时，最后放入真空干燥超速离心机中旋转干燥成白色胶粒。九、目标蛋白的重结晶与纯化:在AnchorChipTM板点样孔上均匀涂上一层CCA基质，将酶解和脱水后的目标蛋白胶粒放入点样孔内，滴入0.1% TFA到样品上并充满点样孔，使胶粒迅速溶解并润洗蛋白，I分钟内吸出点样孔内所有溶液以除去操作中对蛋白造成的污染，并重复3次。加入微量重结晶液使蛋白结晶析出保存。该技术利用待分离蛋白的等电点和分子量的不同，应用二维双向电泳技术，通过电泳分离和重结晶处理达到分离和纯化谷胱甘肽过氧化物酶的目的。与传统的酶蛋白提取技术相比，使用该技术与方法分离纯化得到的酶蛋白具有更高的纯度、更多的数量和更优的科研价值。该技术利用双向电泳技术、胶内蛋白酶解和蛋白重结晶等方法，在金山绣线菊中分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶，经验证利用该技术分离纯化的谷胱甘肽过氧化物酶具有良好的产量和纯度，高纯度的谷胱甘肽过氧化物酶可进一步用于该酶的活性研究、氧化还原与清除氧自由基机理研究、抗逆机制研究、抗逆基因克隆、差异蛋白质组学的相关研究等。【附图说明】图1是【具体实施方式】七中含目标蛋白的凝胶电泳图谱。【具体实施方式】【具体实施方式】一:本实施方式由双向凝胶电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法按以下步骤进行:一、金山绣线菊梯度低温处理；二、金山绣线菊叶片蛋白质的提取:液氮充分研磨金山绣线菊叶片，加入蛋白提取试剂I，-20°C静置过夜。低温过夜后提取液4°C离心2小时留取沉淀，用含0.07% β -巯基乙醇约3倍沉淀体积的冷丙酮重悬沉淀后，在鼓风干燥装置中抽干沉淀。按30 μ 1/mg比例加入蛋白提取试剂II，冰浴后4°C离心I小时留取上清液。三、蛋白质定量与纯化:采用标准曲线法进行蛋白定量，按照2D-Quant试剂盒说明进行蛋白纯化，纯化后的蛋白样品保存于-80°C冰箱中待用。四、第一相固相PH梯度等电聚焦电泳:取蛋白样品溶液均匀滴加并充满胶条槽底部，将胶条轻覆于液层上，在IPGphor电泳仪上进行等电聚焦，聚焦电泳后将胶条分别放入平衡液A、平衡液B中平衡15min，再用双蒸水充分润洗沥干后进行第二相电泳。五、第二相SD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，其特征在于是利用双向电泳技术分离纯化谷胱甘肽过氧化物酶的方法，按以下方法进行：一、金山绣线菊梯度低温处理；二、金山绣线菊叶片蛋白质的提取：液氮充分研磨金山绣线菊叶片，加入蛋白提取试剂I，‑20℃静置过夜。低温过夜后提取液4℃离心2小时留取沉淀，用含0.07％β‑巯基乙醇约3倍沉淀体积的冷丙酮重悬沉淀后，在鼓风干燥装置中抽干沉淀。按30μl/mg比例加入蛋白提取试剂Ⅱ，冰浴后4℃离心1小时留取上清液。三、蛋白质定量与纯化：采用标准曲线法进行蛋白定量，按照2D‑Quant试剂盒说明进行蛋白纯化，纯化后的蛋白样品保存于‑80℃冰箱中待用。四、第一相固相PH梯度等电聚焦电泳：取蛋白样品溶液均匀滴加并充满胶条槽底部，将胶条轻覆于液层上，在IPGphor电泳仪上进行等电聚焦，聚焦电泳后将胶条分别放入平衡液A、平衡液B中平衡15min，再用双蒸水充分润洗沥干后进行第二相电泳。五、第二相SDS‑PAGE凝胶电泳：按常规制胶方法灌制凝胶，之后进行SDS‑PAGE凝胶电泳分离蛋白。六、凝胶平衡与染色：待电泳结束，蛋白充分分离后取出凝胶，放入固定液中固定，再将凝胶转移至热考染液中染色10分钟，蛋白斑点清晰染色后，凝胶放入乙酸液中脱色，脱色至凝胶背景呈无色状态。七、凝胶扫描和图像分析：用UMAX扫描仪扫描染色的聚丙烯酰胺凝胶并获取电子图像，利用专业分析软件2‑D Imagemaster ElitTM分析凝胶图像，给出各个染色蛋白点的实际分子量和等电点。八、目标蛋白胶内酶解与脱水：在凝胶上准确切取分子量为19.095KDa、PI值为8.98的蛋白点(目标蛋白)，在切取的胶团中加入4‑5μl含5ng/μl胰蛋白酶的25mM适量碳酸氢铵溶液，使胶团完全吸涨并酶解12‑14小时。将蛋白酶解体系放入60μl的50％乙晴液中脱水45分钟，再向乙腈液中加入16‑18μl0.5％的适量TFA，将蛋白脱水体系放在4℃摇床上振荡三小时，最后放入真空干燥超速离心机中旋转干燥成白色胶粒。九、目标蛋白的重结晶与纯化：在AnchorChipTM板点样孔上均匀涂上一层CCA基质，将酶解和脱水后的目标蛋白胶粒放入点样孔内，滴入0.1％TFA到样品上并充满点样孔，使胶粒迅速溶解并润洗蛋白，1分钟内吸出点样孔内所有溶液以除去操作中对蛋白造成的污染，并重复3次。加入微量重结晶液使蛋白结晶析出保存；其中步骤二中的蛋白提取试剂I的主要成分包括：10％三氯乙酸丙酮溶液，0.07％β‑巯基乙醇；蛋白提取试剂Ⅱ的主要成分包括：7.0mol/L尿素，40mmol/L二硫苏糖醇，4％两性电解质表面活性剂，2.0mol/L硫脲；步骤四中的平衡液A的成分包括：50mmol/L Tris‑HCI，pH6.8，8mol/L尿素，30％甘油，1％十二烷基硫酸钠，0.2％二硫苏糖醇；平衡液B的成分包括：以3％碘乙酰胺替换平衡液A中的0.2％二硫苏糖醇并加痕量溴酚蓝，其他成分相同；步骤六中固定液主要成分为：40％乙醇：10％乙酸(3:1)；热考染液配制：微量R350溶于1600ml冰乙酸。步骤九中的重结晶液的成分包括：0.1g CCA溶于6:3:1的乙醇：丙酮：0.1％TFA溶液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧民，张娇，王大庆，聂颖，刘记璇，刘冰冰，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23