一种酶法制备谷胱甘肽的工艺方法技术

本发明专利技术提供一种酶法制备谷胱甘肽的工艺方法，其特征在于包括以下步骤：1）向反应釜中加入L‑谷氨酸钠（L‑Glu.Na)，L‑半胱氨酸(L‑Cys)，甘氨酸(Gly)，三磷酸腺苷二钠（ATP.Na2），六水氯化镁（MgCl2.6H2O），六偏磷酸钠[(NaPO3)6 ]，二硫苏糖醇（DTT）和纯化水搅拌溶解；2）采用抽真空氮气置换的方法置换反应体系中的空气，置换完毕氮气保护整个反应体系；3）在25‑45℃、氮气保护下，用碱性溶液调节pH值至6.0‑8.0；4）加入反应液1%‑3%的谷胱甘肽酶液，氮气保护下、25‑45℃搅拌反应2‑4h，反应过程中用碱性溶液控制反应体系pH值在6.0～8.0。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种谷胱甘肽的制备工艺，属于医药及其中间体

技术介绍
谷胱甘肽(glutathione,r-glutamylcysteingl+glycine,GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故常简写为G-SH），易与某些药物（如扑热息痛）、毒素（如自由基、碘乙酸、芥子气，铅、汞、砷等重金属）等结合，而具有整合解毒作用。谷胱甘肽的生产方法主要有化学合成法、酶转化法和发酵法。目前，化学合成法和提取法已经工业化，化学合成法较早应用于谷胱甘肽的生产，但存在复杂耗时的缺点。生物合成方法包括酶转化法和微生物发酵法，微生物发酵法用于谷胱甘肽的生产是当前世界上主要的生产方法，并且由于避免了昂贵的ATP消耗，比较经济实用，国外谷胱甘肽的主要产地在日本，应用的是微生物发酵法生产谷胱甘肽。国内由微生物发酵生产谷胱甘肽,在添加三种氨基酸前体的情况下，发酵单位一般在4-8g/L。我们主要研究酶转化法。酶转化法生产谷胱甘肽由于需要获得相关酶系，需要为其设计ATP再生体系，还需要加入前体氨基酸，因此技术难度高，但酶转化法比化学法及发酵法相比，有较大成本优势。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种工艺成本低，反应条件温和，操作方法简单可控，避免了大量有毒试剂的使用，环保安全性好，产品质量稳定的谷胱甘肽合成工艺。技术方案：本专利技术采用的谷胱甘肽酶液（GSH酶）是通过本申请人提交的申请号为201610167116.3一种催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制备和提取方法来制备。一种酶法制备谷胱甘肽的工艺方法，包括以下步骤：1）向反应釜中加入L-谷氨酸钠（L-Glu.Na)，L-半胱氨酸(L-Cys)，甘氨酸(Gly)，三磷酸腺苷二钠（ATP.Na2），六水氯化镁（MgCl2.6H2O），六偏磷酸钠[(NaPO3)6]，二硫苏糖醇（DTT）和纯化水搅拌溶解；2）采用抽真空氮气置换的方法置换反应体系中的空气三次，置换完毕氮气保护整个反应体系；3）在25-45℃、氮气保护下，用碱性溶液调节pH值至6.0-8.0；4）加入反应液1%-3%的谷胱甘肽酶液，氮气保护下、25-45℃搅拌反应2-4h，反应过程中用碱性溶液控制反应体系pH值在6.0-8.0；5）反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；6）将得到的滤液通过超滤机进行超滤，收集超滤透析液；7）将超滤透析液调酸后上DA201-C型大孔吸附树脂柱；该大孔树脂柱的径高比为0.05-0.2，上样pH值为2.0-3.5；8）用1-3bv的纯化水冲洗大孔树脂柱；9）用50%-95%的乙醇洗脱解吸附大孔树脂柱，收集茚三酮显色部分洗脱液；10）将收集的洗脱液30-50℃减压浓缩，真空度≤-0.09MPa，浓缩至GSH含量为15%-30%；11）往浓缩液中加入0.5-1.5倍量的有机溶剂，氮气保护下、0-25℃（优选10-15℃）搅拌析晶10-24h（优选18-20h）；12）析晶完毕，放料离心，乙醇洗涤，30-50℃减压至真空度≤-0.09MPa，干燥6-8h，得谷胱甘肽粗品。作为优选，步骤1）中L-Glu.Na的投料量为9-16g/L，L-Cys的投料量为6-11g/L，Gly的投料量为4-8g/L，ATP.Na2的投料量为0.6-1.2g/L，MgCl2.6H2O投料量为14-24g/L，(NaPO3)6投料量为21-40g/L，DTT投料量为0.1-1.5g/L。作为优选，上述步骤中的碱性溶液为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氨水中的一种。作为优选，步骤11）中的有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种。本专利技术的有益技术效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1）本专利技术采用酶集GSH合成与ATP/TDP（生物膜）循环再生功能于一体，有效循环利用ATP，大大降低了生产成本；2）本专利技术的生物酶法转化率高（100%），工艺简单，后期纯化难度小，相比发酵法（后期采用了氧化亚铜沉淀和硫化氢还原），其纯化工艺更加绿色环保（仅用到了乙醇/水）；3）本专利技术生产周期短，收率高，成本低，利润空间大；4）本专利技术所产反应液中GSH浓度高达到20g/L（文献报道最高为8g/L）；5）本专利技术所采用的GSH合成酶结合了高活性的GSH双功能合成酶和ATP合成酶，构建了ATP的再生系统，大大减少了ATP的投料量，降低了生产成本；6）本专利技术利用DA201-C型大孔吸附树脂除盐，对反应液进行提纯，避免使用传统的铜盐法（氧化亚铜沉淀、硫化氢还原），减少环境污染，减轻环保压力；7）相比发酵法、两步酶法，本专利技术为一步酶法，其反应周期短，更利于产业化，能耗低；三废少，绿色环保。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例一：1、向反应釜中加入L-谷氨酸钠（L-Glu.Na)，L-半胱氨酸(L-Cys)，甘氨酸(Gly)，三磷酸腺苷二钠（ATP.Na2），六水氯化镁（MgCl2.6H2O），六偏磷酸钠[(NaPO3)6]，二硫苏糖醇（DTT）和纯化水搅拌溶解。其中L-Glu.Na的投料量为9g/L，L-Cys的投料量为6g/L，Gly的投料量为4g/L，ATP.Na2的投料量为0.6g/L，MgCl2.6H2O投料量为14g/L，(NaPO3)6投料量为21g/L，DTT投料量为0.1g/L；反应体系体积为50L；2、采用抽真空氮气置换的方法置换反应体系中的空气三次，置换完毕氮气保护整个反应体系；3、在25℃、氮气保护下，用氢氧化钠溶液调节pH值至6.0；4、加入反应液1%-3%的GSH酶液，氮气保护下、25℃搅拌反应2h，反应过程中用氢氧化钠溶液控制反应体系pH值在6.0；5、反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；6、将得到的滤液通过超滤机进行超滤，收集超滤透析液；7、将超滤透析液调酸后上DA201-C型大孔吸附树脂柱。大孔树脂柱的径高比为0.05，上样pH值为2.0；8、用纯化水以0.5bv/h的速度冲洗大孔树脂柱；9、用50%的乙醇洗脱解吸附大孔树脂柱，收集茚三酮显色部分洗脱液；10、将收集的洗脱液30℃减压浓缩，真空度≤-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法制备谷胱甘肽的工艺方法，其特征在于包括以下步骤：1）向反应釜中加入L‑谷氨酸钠（L‑Glu.Na)，L‑半胱氨酸(L‑Cys)，甘氨酸(Gly)，三磷酸腺苷二钠（ATP.Na2），六水氯化镁（MgCl2.6H2O），六偏磷酸钠[(NaPO3)6 ]，二硫苏糖醇（DTT）和纯化水搅拌溶解；2）采用抽真空氮气置换的方法置换反应体系中的空气，置换完毕氮气保护整个反应体系；在25‑45℃、氮气保护下，用碱性溶液调节pH值至6.0‑8.0；3）加入反应液1%‑3%的谷胱甘肽酶液，氮气保护下、25‑45℃搅拌反应2‑4h，反应过程中用碱性溶液控制反应体系pH值在6.0‑8.0；4）反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；5）将得到的滤液通过超滤机进行超滤，收集超滤透析液；6）将超滤透析液调酸后上DA201‑C型大孔吸附树脂柱；该大孔树脂柱的径高比为0.05‑0.2，上样pH值为2.0‑3.5；7）用1‑3bv的纯化水冲洗大孔树脂柱；8）用50%‑95%的乙醇洗脱解吸附大孔树脂柱，收集茚三酮显色部分洗脱液；9）将收集的洗脱液30‑50℃减压浓缩，真空度≤‑0.09MPa，浓缩至GSH含量为15%‑30%；10）往浓缩液中加入0.5‑1.5倍量的有机溶剂，氮气保护下、0‑25℃（优选10‑15℃）搅拌析晶10‑24h（优选18‑20h）；11）析晶完毕，放料离心，乙醇洗涤，30‑50℃减压至真空度≤‑0.09MPa，干燥6‑8h，得谷胱甘肽粗品。...

【技术特征摘要】
1.一种酶法制备谷胱甘肽的工艺方法，其特征在于包括以下步骤：
1）向反应釜中加入L-谷氨酸钠（L-Glu.Na)，L-半胱氨酸(L-Cys)，甘氨酸(Gly)，三磷酸
腺苷二钠（ATP.Na2），六水氯化镁（MgCl2.6H2O），六偏磷酸钠[(NaPO3)6]，二硫苏糖醇
（DTT）和纯化水搅拌溶解；
2）采用抽真空氮气置换的方法置换反应体系中的空气，置换完毕氮气保护整个反应体
系；
在25-45℃、氮气保护下，用碱性溶液调节pH值至6.0-8.0；
3）加入反应液1%-3%的谷胱甘肽酶液，氮气保护下、25-45℃搅拌反应2-4h，反应过程中
用碱性溶液控制反应体系pH值在6.0-8.0；
4）反应完毕，放料，料液离心除去不溶物，收集滤液；
5）将得到的滤液通过超滤机进行超滤，收集超滤透析液；
6）将超滤透析液调酸后上DA201-C型大孔吸附树脂柱；该大孔树脂柱的径高比为0.05-
0.2，上样pH值为2.0-3.5；
7）用1-3bv的纯化水冲洗大孔树脂柱；
8）用50%-95%的乙醇洗脱解吸附大孔树脂柱，收集茚三酮显色部分洗脱液；
9）将收集的洗脱液30-50℃减压浓缩，真空度≤-0.09MPa，浓缩至GSH含量为15...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴锋，许刘华，刘晓庆，周江，华俊国，
申请(专利权)人：江苏诚信药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32