IgG2型单抗二硫键配对分析方法技术

本发明专利技术公开一种IgG2型单抗二硫键配对分析方法，该方法包括步骤：1)、对蛋白质进行变性处理；2)、在非还原条件下使用特异性酶酶解变性处理后的蛋白质；3)、将酶解后的蛋白质分成两份样品，其中一份样品加入DTT进行还原，另一份样品不还原，两份样品均终止酶解；4)、对终止酶解后的样品的二硫键肽段进行质量肽谱图分析。本发明专利技术的方法可克服较为繁琐多种酶切处理方式，采用单一酶胰蛋白酶在非还原条件下酶解抗体蛋白，可以排除抗体蛋白特殊氨基酸序列对酶解蛋白时的空间位阻作用，能准确确认和定位二硫键肽段，并能检测到错配二硫键肽段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种单抗二硫键配对分析方法。
技术介绍
二硫键即S-S键，是2个巯基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的共价键，是一种常见的蛋白质翻译后修饰，交联多肽链内或链间的两个半胱氨酸，在形成稳定的蛋白质空间结构、保持正确的空间构象、调节生物学活性方面起着非常重要的作用。二硫键正确配对利于肽链迅速折叠并形成紧密的、稳定的空间结构，形成局部疏水中心，能阻止水分子进入肽的内部破坏氢键，形成稳定的高级结构区域。二硫键只具有相对的稳定性，其共价键容易被还原而断裂，当二硫键被断开还原为巯基基团时，蛋白质结构及构象必然发生改变，可能完全或部分丧失原有的生物学功能，巯基含量较高的抗体具有较低的生物活性和较低的热稳定性(Chader jian WB，Chin ET，Harris RJ，et al.Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed.Biotechnology Progress 2005；21(2):550-553；Lacy ER,Baker M,Brigham-Burke M.Free sulfhydryl measurement as an indicator of antibody stability.Analytical Biochemistry 2008；382:66-8)。正确的二硫键配对方对抗体蛋白药物生物学活性至关重要，错配或不能完全形成二硫键往往意味活性的降低(Ouellette D,Alessandri L,Chin A,Grinnell C,Tarcsa E,Radziejewski C,et al.Studies in serum support rapid formation of disulfide bond between unpaired cysteine residues in the VH domain of an immunoglobulin G1molecule.Analytical Biochemistry 2010；397:37-47)。抗体蛋白狄迪诺塞麦(Denosumab)是一种典型的IgG2类型抗体，其铰链区有4对二硫键(Liu H，May K.Disulfide bond structures of IgG molecules.mAbs 2012；4:117-23)，其本身结构容易形成二硫键。在细胞株克隆筛选、纯化工艺确认、制剂配方筛选、产品稳定性
确认等研发周期过程中，监控二硫键配对可以判断抗体蛋白工艺开发的成熟度。现有的技术方法多是采用几种特异性酶进行联合酶解来确认Denosumab的二硫键配对形式，非常不方便。因此，一种简单、有效的单抗二硫键配对分析方法仍是目前急需解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种IgG2型单抗(如Denosumab)二硫键配对分析方法，该方法克服了现有技术中使用酶切方式较多的缺点，减少了酶切方式，能准确确认和定位二硫键肽段，并能检测到错配二硫键肽段。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种蛋白质二硫键配对分析方法，包括如下步骤：1、对蛋白质进行变性处理；2、在非还原条件下使用特异性酶酶解变性处理后的蛋白质；3、将酶解后的蛋白质分成两份样品，其中一份样品加入DTT进行还原，另一份样品不还原，两份样品均终止酶解；4、对终止酶解后的样品的二硫键肽段进行质量肽谱图分析。较佳的，所述蛋白质是抗体蛋白；进一步的所述蛋白质是IgG2型单抗如狄迪诺塞麦(Denosumab)。较佳的，步骤1中，所述变性处理使用的缓冲液为盐酸胍；优选的变性样品体系中盐酸胍浓度为5M～7.6M。在一具体实例中，所述变性处理使用的缓冲液为8M盐酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3。较佳的，步骤2中，所述特异性酶为胰蛋白酶；优选胰蛋白酶的用量为1﹕5～12(wt/wt，酶/蛋白)；更优选胰蛋白酶的用量为1﹕10(wt/wt，酶/蛋白)。在其它具体实例中，所述特异性酶为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、Lys-C酶；优选胰蛋白酶的用量为1﹕25(wt/wt，酶/蛋白)；优选胰凝乳蛋白酶的用量为1:50(wt/wt，酶/蛋白)；优选弹性蛋白酶的用量为1:50(wt/wt，酶/蛋白)；优选Lys-C酶的用量为1:200(wt/wt，酶/蛋白)。较佳的，步骤3中使用DTT对所述其中一份样品进行还原；优选DTT的浓度为60mM。较佳的，步骤3中加入甲酸(FA)终止酶解；优选加入所述甲酸至体积终浓
度0.1％。较佳的，步骤4中使用ESI-Q-TOF MS方法进行分析，所得数据采用BiopharmaLynx软件进行处理分析。在另一具体实例中，所述ESI-Q-TOF MS分析采用以下方法实现：将抗体蛋白肽段样品用50mM NH4HCO3(pH8.0)溶液稀释至1.5-2mg/mL(以酶解前蛋白浓度计)；然后Waters Acquity UPLC BEH300C181.7μm 2.1×150mm色谱柱分离；进行Q-TOF质谱分析。本专利技术所述抗体蛋白狄迪诺塞麦(Denosumab)轻链含有5个半胱氨酸Cys，分别为Cys23、Cys89、Cys135、Cys195、Cys215，重链含13个半胱氨酸Cys，分别为Cys22、Cys96、Cys136、Cys 149、Cys205、Cys224、Cys225、Cys228、Cys231、Cys262、Cys322、Cys368、Cys426，从轻链N-末端开始到C-末端分别标示为1C～5C，从重链N-末端开始到C-末端分别标示为6C～18C，理论配对链内二硫键为1C/2C、3C/4C、6C/7C、9C/10C、15C/16C、17C/18C，链间二硫键为5C/8C，铰链区二硫键为11C+12C+13C+14C/11C+12C+13C+14C。实验结果表明，胰蛋白酶加入量为1：15及以上时，二硫键肽段6C/7C的丰度相对较低，其b、y离子个数较少，优选地胰蛋白酶加入量为1：10碎片离子信息较为丰富，这比通过几种特异性酶进行组合酶切确认所有二硫键配对的方式更简单更方便。总之，与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：本专利技术通过单一酶胰蛋白酶酶切能确认抗体蛋白狄迪诺塞麦全部二硫键配对，不需要多种酶组合酶切，并且碎片离子较为丰富，同时能检测到部分错配二硫键肽段。附图说明图1为本专利技术实施例1抗体蛋白二硫键肽段(1C/2C)碎片离子图；图2为本专利技术实施例1抗体蛋白二硫键肽段(3C/4C)碎片离子图；图3为本专利技术实施例1抗体蛋白二硫键肽段(5C/8C)碎片离子图；图4为本专利技术实施例1抗体蛋白二硫键肽段(6C/7C)碎片离子图；图5为本专利技术实施例1抗体蛋白二硫键肽段(9C/10C)碎片离子图；图6为本专利技术实施例1抗体蛋白二硫键肽段(11C+12C+13C+14C\本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质二硫键配对分析方法，依次包括如下步骤：1)、对蛋白质进行变性处理；2)、在非还原条件下使用特异性酶酶解变性处理后的蛋白质；3)、将酶解后的蛋白质分成两份样品，其中一份样品加入DTT进行还原，另一份样品不还原，两份样品均终止酶解；4)、对终止酶解后的样品的二硫键肽段进行质量肽谱图分析。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质二硫键配对分析方法，依次包括如下步骤：1)、对蛋白质进行变性处理；2)、在非还原条件下使用特异性酶酶解变性处理后的蛋白质；3)、将酶解后的蛋白质分成两份样品，其中一份样品加入DTT进行还原，另一份样品不还原，两份样品均终止酶解；4)、对终止酶解后的样品的二硫键肽段进行质量肽谱图分析。2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中使用盐酸胍进行变性处理。3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中所述特异性酶为胰蛋白酶。4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤4)中使用ESI-Q-TOF MS方法进行分析。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：吕锋华，环民霞，刘周阳，谭青乔，
申请(专利权)人：三生国健药业上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31