一种纯固相合成醋酸鲑降钙素的方法技术

本发明专利技术属于药物合成技术领域，公开了一种纯固相合成醋酸鲑降钙素的方法，该方法将二硫键的形成改在树脂上进行，避免了大量废液废水的产生，纯化压力小，最终收率也获得了较大的提高。

【技术实现步骤摘要】
一种纯固相合成醋酸鲑降钙素的方法
本专利技术涉及药物合成
，具体涉及醋酸鲑降钙素的纯固相合成方法。
技术介绍
醋酸鲑降钙素能够抑制破骨细胞的活性；抑制骨盐溶解，阻止骨内钙释出；改善骨密度，有效缓解疼痛症状；降低骨折的危险性和降低血钙。因此，临床上主要用于治疗老年骨质疏松症，绝经后骨质疏松症，骨转移癌致高钙血症。其分子式为C145H240N44O48S2；分子量为3431.85；CAS登记号为47931-85-1；其肽序如下式所示：H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2。目前，固相制备鲑降钙素的方法主要有Boc法和Fmoc法。已公开的美国专利采用了Boc法合成鲑降钙素，该方法使用剧毒、腐蚀性试剂，三废多，工艺复杂，成本高，工业化实施具有一定的难度，不能满足临床应用的需要。中国专利CN1865283B采用了Fmoc法合成鲑降钙素，该方法先偶联线性肽树脂，然后用双氧水液相氧化，最终收率达到21.8％。而中国专利CN103254305B同样采用相同的Fmoc策略，固液相结合的方法制备了鲑降钙素，但其液相氧化在空气环境中进行，最终收率仅达到17.2％。上述两项中国专利均采用Fmoc法合成鲑降钙素，由于需要进行液相反应，反应浓度低，因此存在设备要求高，三废多，后期处理成本高等难以克服的问题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述缺陷，提供了一种纯固相合成醋酸鲑降钙素的方法，该方法将二硫键的形成改在树脂上进行，避免了大量废液废水的产生，纯化压力小，最终收率也获得了较大的提高。为此，本专利技术一方面提供了一种固相合成醋酸鲑降钙素的方法，包括如下步骤：1、将Fmoc-Pro-OH与树脂偶联，获得Fmoc-Pro-树脂；2、Fmoc-Pro-树脂采用逐一偶联的方式获得鲑降钙素全保护线性肽树脂；3、鲑降钙素全保护线性肽树脂在树脂上完成成环反应，形成环肽，即鲑降钙素肽树脂；4、鲑降钙素肽树脂经裂解反应，获得鲑降钙素粗肽；5、鲑降钙素粗肽经纯化、转盐和冻干后获得醋酸鲑降钙素精肽。在本专利技术优选的实施方案中，步骤1中的树脂选自氨基树脂，更加优选为RinkAmideResin。在本专利技术优选的实施方案中，步骤1中获得的Fmoc-Pro-树脂的替代度为0.2～0.4mmol/g。在本专利技术优选的实施方案中，在步骤2所述的逐一偶联的方式中，Ser、Thr、Tyr的保护基为tBu，Glu的保护基为OtBu，Gln的保护基为Trt，Lys的保护基为Boc，更加特别的，His的侧链保护基为Boc，Cys的侧链保护基为Acm，且最终的N端保护基为Boc。在本专利技术进一步优选的实施方案中，步骤2中按照鲑降钙素长链的顺序依次偶联Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-RinkAmideResin。在本专利技术优选的实施方案中，在步骤2所述的逐一偶联的方式中，Fmoc-His(Boc)-OH的偶联体系为HATU/HOAt/TMP、Fmoc-Cys(Acm)-OH的偶联体系为PyBOP/HOAt/DIPEA、Boc-Cys(Acm)-OH的偶联体系为PyAOP/HOAt/TMP。在本专利技术优选的实施方案中，步骤3中成环反应所采用的氧化剂为碘，其中碘的使用量优选为合成规模的8～10倍，反应时间优选为2～5小时。在本专利技术优选的实施方案中，步骤3中在树脂上采用碘同时完成侧链保护基Acm的脱除以及二硫键的成环。在本专利技术优选的实施方案中，步骤4中所述的裂解反应所采用的裂解试剂为TFA:TIS:H2O＝90～98:0～5:2～5(V:V)，更加优选为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)。在本专利技术优选的实施方案中，所述的纯化方法为反相高效液相色谱纯化法，色谱柱为反相C18柱。由上述描述可知，与现有技术相比，本专利技术采用了纯固相的方法合成了醋酸鲑降钙素，该方法克服了现有技术中设备要求高，工艺处理繁琐，纯化困难和收率较低的缺陷。首先，本专利技术将二硫键的形成改在树脂上进行，从而避免了对后续氧化的设备、溶剂和纯化的要求，提高了收率。其次，本专利技术采用Acm作为Cys的侧链保护基团，与现有的Trt基团相比，进一步提高了精肽的收率。最后，由于鲑降钙素的肽序中含有His，极易消旋，而且难以检测。本专利技术则采用了特定的原料Fmoc-His(Boc)-OH，极大地降低了His消旋的发生，并且所采用的检测方法也完全能够检测出His的消旋。附图说明图1为采用本专利技术的纯固相合成方法制备的醋酸鲑降钙素精肽的RP-HPLC谱图。其中醋酸鲑降钙素精肽的纯度为98.98％。图2为采用本专利技术的纯固相合成方法制备的醋酸鲑降钙素精肽中D-His的谱图。其中RT21.9min为D-His，含量为0.29％。图3为采用常规固液相结合法制备的鲑降钙素精肽的RP-HPLC谱图。其中鲑降钙素精肽的纯度为98.89％。图4为采用常规固液相结合法制备的鲑降钙素精肽中D-His的谱图。其中RT21.763min为D-His，含量为2.73％。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步的详细说明，旨在用于说明本专利技术而非限定本专利技术。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以对本专利技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本专利技术的保护范围之内。本专利技术所使用的缩写的含义列于下表中。实施例1：替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Pro-RinkAmideResin的合成称取替代度为1.0mmol/g的RinkAmideresin1000g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK(20％哌啶/DMF)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。称取168.7gFmoc-Pro-OH(500mmol)和81.0gHOBt(600mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液中，冰水浴下加入93.8mlDIC(600mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入3487.8ml封闭液(吡啶/乙酸酐＝1:1，20mol:20mol)封闭8小时(树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂)。用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Pro-RinkAmideResin。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0.411mmol/g。实施例2：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Pro-RinkAmideResin的合成称取替代度为1.0mmol/g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固相合成醋酸鲑降钙素的方法，包括如下步骤：1)将Fmoc‑Pro‑OH与树脂偶联，获得Fmoc‑Pro‑树脂；2)Fmoc‑Pro‑树脂采用逐一偶联的方式获得鲑降钙素全保护线性肽树脂；3)鲑降钙素全保护线性肽树脂在树脂上完成成环反应，形成环肽，即鲑降钙素肽树脂；4)鲑降钙素肽树脂经裂解反应，获得鲑降钙素粗肽；5)鲑降钙素粗肽经纯化、转盐和冻干后获得醋酸鲑降钙素精肽。

【技术特征摘要】
1.一种固相合成醋酸鲑降钙素的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将Fmoc-Pro-OH与树脂偶联，获得Fmoc-Pro-树脂；2)Fmoc-Pro-树脂采用逐一偶联的方式获得鲑降钙素全保护线性肽树脂；3)鲑降钙素全保护线性肽树脂在树脂上完成成环反应，形成环肽，即鲑降钙素肽树脂；4)鲑降钙素肽树脂经裂解反应，获得鲑降钙素粗肽；5)鲑降钙素粗肽经纯化、转盐和冻干后获得醋酸鲑降钙素精肽；其中在步骤2)所述的逐一偶联的方式中，His的侧链保护基为Boc，Cys的侧链保护基为Acm，且最终的N端保护基为Boc。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤1)所述的树脂为氨基树脂。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤1)获得的Fmoc-Pro-树脂的替代度为0.2～0.4mmol/g。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中在步骤2)中按照鲑降钙素长链的顺序依次偶联Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Boc)-Lys(Boc)-Leu-G...

【专利技术属性】
技术研发人员：宓鹏程，陶安进，伍柯瑾，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44