一种地加瑞克的固相合成方法技术

本发明专利技术公开了一种地加瑞克及原料的合成方法，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，用ivdde代替5位苯丙氨酸苯环4位氨基相连的乳清酸片段，从C端到N端依次缩合反应连接10个保护的氨基酸，得到全保护肽树脂，然后脱掉N端D-Nal的Fmoc保护基，用乙酸酐和吡啶乙酰化，脱掉ivDde替换上Hor，用裂解试剂切割肽树脂，冰乙醚沉淀得到粗肽。此外，本发明专利技术还涉及到用ivDde-OH和Fmoc-Aph-OH合成原料Fmoc-Aph(ivDde)-OH的方法。本发明专利技术先引入了ivDde合成十肽，之后再替换上Hor避免了重排副反应的发生，工艺步骤简单，易于控制，对人体和环境影响小，产率高，适合大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种地加瑞克的固相合成方法
本专利技术涉及一种地加瑞克的固相合成方法。
技术介绍
地加瑞克(degarelix)，商品名为Firmagon，是FerringPharmaceuticals公司开发的degarelix粉针剂，经美国FDA批准，2008年12月24日在美国上市。适应症：FIRMAGON是GnRH受体拮抗剂用于治疗晚期前列腺癌。地加瑞克系一促性腺激素释放激素(GnRH)受体抑制剂类药物，可逆性抑制垂体GnRH受体来减少促性腺激素释放继而抑制睾酮的释放。地加瑞克通过抑制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮来延缓前列腺癌的生长和恶化。以激素治疗前列腺癌来降低睾酮浓度的初期却造成睾酮浓度激增，此初始刺激该激素受体可暂时性促进肿瘤生长而不是抑制它，而地degarelix则不会。Ⅲ期临床研究显示，地加瑞克降低睾酮浓度的效果至少可与亮丙瑞林储库型控释注射剂(LupronDepot)相媲美，而且降低睾酮浓度在统计学上显著快。在治疗的第3日，地加瑞克组96％达到去生殖腺的睾酮浓度，亮丙瑞林组效果为0％。第14日，地加瑞克组99％达到去生殖腺的睾酮浓度，亮丙瑞林组为18％。在临床研究中，前列腺特异抗原(PSA)浓度可作为监测的第2个疗效判断终点。使用degarelix两周后降低PSA64％，1月后85％，3月后95％，在治疗的整个1年中始终抑制PSA。副作用表现为：注射部位反应(如疼痛，红斑，肿胀，或硬结)，潮热，体重增加，血清转氨酶和γ-谷氨酰转肽酶(GGT增加)。地加瑞克为含有七个非天然氨基酸的线性十肽，分子量为1632.26，CAS登记号为214766-78-6，其氨基酸序列为Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH2。结构式如下。专利文献WO9846634报道了一种Boc固相合成法合成地加瑞克的方法，将Boc-D-Ala-OH和MBHA树脂进行偶联，然后再洗涤，用酸脱除Boc保护基，连接下一个氨基酸，其中5位和6位的4Aph的侧链采用Fmoc保护，然后用哌啶/DMF溶液脱除保护基，侧链上再分别添加L-Hor和Cbm基团。此外，WO2011066386和US5925730也是采用Boc固相合成法合成地加瑞克，专利文献WO2011066386中的Ser侧链用容易酸解离得Trt保护，但由于Trt保护基的位阻大和它的疏水性，造成接肽比较困难，需要较长的时间连接，容易产生副产物和消旋。此外，Boc固相合成法都需要用HF进行裂解，对人体和环境都会造成很大危害。专利文献WO2010121835公开了一种Fmoc固相合成法合成地加瑞克的方法，5位和6位分别用Fmoc-Aph(L-hor)-OH和Fmoc-Aph(tBuCbm)-OH进行偶联。根据相关文献，5位4-氨基苯丙氨酸侧链上的氢化乳清酸片段在碱性环境下不稳定，容易发生重排生成海因结构的副产物，上述专利在接完5位氨基酸后，需要用哌啶/DMF碱溶液反复脱保护，容易发生异构化。专利文献CN102329373A和CN102952174A合成地加瑞克的也是用Fmoc策略固相合成法合成的，它们的5位4-氨基苯丙氨酸侧链先用Trt或Alloc保护，接完十肽后，脱除保护基再添加上Hor。侧链上的Trt保护基需要用TFA脱除，在酸脱除过程中，ILys侧链上的Boc保护基容易脱落，此外，肽和树脂接头处也容易在TFA处理时发生断裂。侧链上的Alloc保护基脱除时容易引入重金属物质，不适合药物合成。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种步骤精简且收率高的地加瑞克的固相合成方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种地加瑞克的固相合成方法，该方法包括如下步骤：(1)将ivDde-OH和Fmoc-Aph-OH溶于无水乙醇中，加入三氟乙酸，回流反应，TLC检测反应进程，合成Fmoc-Aph(ivDde)-OH，反应完成后，蒸干，稀盐酸和饱和NaCl溶液各洗一次，纯化得到双保护氨基酸；(2)采用Fmoc固相合成策略，利用偶联剂依次将Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(X)-OH、步骤(1)制得的Fmoc-4Aph(ivDde)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH按照地加瑞克氨基酸的序列连接至氨基树脂上，得到Fmoc-十肽树脂，即Fmoc-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(ivDde)-D-4Aph(X)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-氨基树脂；(3)将步骤(2)得到的Fmoc-十肽树脂脱除Fmoc保护基，然后乙酰化N端的氨基酸制备得到AC-十肽树脂，即AC-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(ivDde)-D-4Aph(X)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-氨基树脂；(4)将步骤(3)得到的AC-十肽树脂脱除ivDde保护基，然后用偶联剂将乳清酸连到C端第5位氨基酸上，切割肽树脂，得到地加瑞克粗肽；其中，X为Cbm保护基或tBuCbm保护基。步骤(1)中，ivDde-OH、Fmoc-Aph-OH和三氟乙酸的反应摩尔当量比为1.1：1：0.1。步骤(2)和(3)中，所述的氨基树脂为Rink-Amide-MBHA树脂或Rink-Amide-AM树脂。步骤(2)和(4)中，所述的偶联剂为以下三种混合物中的任选一种：HBTU、Y试剂和DIEA按摩尔当量比1:1:2的混合物；HATU、Y试剂和DIEA按摩尔当量比1:1:2的混合物；DIC与Y试剂按摩尔当量比1:1的混合物；其中，所述的Y试剂为HoBt或HoAt。步骤(2)中，按1:(1～6):(1～6):(1～6):(2～12)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc保护氨基酸、HoBt、HBTU和DIEA，将Fmoc保护氨基酸、HoBt溶于二甲基甲酰胺，冰上预活化，加入HBTU和DIEA，然后再加入溶胀后的氨基树脂，室温震荡反应0.5～3小时连接Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸之前用哌啶的N,N二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为3～5分钟和15～25分钟，每次连接上一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需要用二甲基甲酰胺洗涤3～10次。步骤(2)中，溶胀后的氨基树脂按如下方法制备得到：将Fmoc保护的氨基树脂装入到固相反应器中，DCM溶胀两次，每次1h，抽去溶剂，DMF洗涤2～6次，哌啶的N,N二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为3～5分钟和15～25分钟，优选时间分别为5分钟和20分钟，DMF洗涤2～6次，茚三酮检测法检测脱除效果。步骤(3)中，将Fmoc-十肽树脂脱除Fmoc保护基的方法是用哌啶的N,N二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基。步骤(3)中，乙酰化N端的氨基酸制备得到AC-十肽树脂的方法是，在脱除了Fmoc保护基的十肽树脂中，加入醋酸酐和DCM的混合溶液，反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将ivDde‑OH和Fmoc‑Aph‑OH溶于无水乙醇中，加入三氟乙酸，回流反应，合成Fmoc‑Aph(ivDde)‑OH；(2)采用Fmoc固相合成策略，利用偶联剂依次将Fmoc‑D‑Ala‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑ILys(Boc)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑D‑4Aph(X)‑OH、步骤(1)制得的Fmoc‑4Aph(ivDde)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑D‑3Pal‑OH、Fmoc‑D‑Phe(4Cl)‑OH、Fmoc‑D‑2Nal‑OH按照地加瑞克氨基酸的序列连接至氨基树脂上，得到Fmoc‑十肽树脂，即Fmoc‑D‑2Nal‑D‑Phe(4Cl)‑D‑3Pal‑Ser(tBu)‑4Aph(ivDde)‑D‑4Aph(X)‑Leu‑ILys(Boc)‑Pro‑D‑Ala‑氨基树脂；(3)将步骤(2)得到的Fmoc‑十肽树脂脱除Fmoc保护基，然后乙酰化N端的氨基酸制备得到AC‑十肽树脂，即AC‑D‑2Nal‑D‑Phe(4Cl)‑D‑3Pal‑Ser(tBu)‑4Aph(ivDde)‑D‑4Aph(X)‑Leu‑ILys(Boc)‑Pro‑D‑Ala‑氨基树脂；(4)将步骤(3)得到的AC‑十肽树脂脱除ivDde保护基，然后用偶联剂将乳清酸连到C端第5位氨基酸上，切割肽树脂，得到地加瑞克粗肽；其中，X为Cbm保护基或tBuCbm保护基。...

【技术特征摘要】
1.一种地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将ivDde-OH和Fmoc-Aph-OH溶于无水乙醇中，加入三氟乙酸，回流反应，合成Fmoc-Aph(ivDde)-OH；(2)采用Fmoc固相合成策略，利用偶联剂依次将Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-ILys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-4Aph(X)-OH、步骤(1)制得的Fmoc-4Aph(ivDde)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH按照地加瑞克氨基酸的序列连接至氨基树脂上，得到Fmoc-十肽树脂，即Fmoc-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(ivDde)-D-4Aph(X)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-氨基树脂；(3)将步骤(2)得到的Fmoc-十肽树脂脱除Fmoc保护基，然后乙酰化N端的氨基酸制备得到AC-十肽树脂，即AC-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(ivDde)-D-4Aph(X)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-氨基树脂；(4)将步骤(3)得到的AC-十肽树脂脱除ivDde保护基，然后用偶联剂将乳清酸连到C端第5位氨基酸上，切割肽树脂，得到地加瑞克粗肽；其中，X为tBuCbm保护基；步骤(4)中，将AC-十肽树脂脱除ivDde保护基的方法是，用含有2％v/v的肼的DMF溶液脱除ivDde保护基，脱两次，每次30min，抽干溶液，DMF洗涤2～6次；步骤(4)中，切割肽树脂的方法是将三氟乙酸、苯甲硫醚、苯甲醚、1,2-乙二硫醇按体积比90:5:3:2混合，将连接了乳清酸后的AC-十肽树脂加入上述混合液，40℃震荡反应0.5～4小时后，将反应液过滤加入冷乙醚中，沉淀，离心后收集沉淀，得到地加瑞克粗肽。2.根据权利要求1所述的地加瑞克的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中，ivDde-OH、Fmoc-Aph-OH和三氟乙酸的反应摩尔当量比为1.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：董守良，曹硕，李兆亮，葛鑫，
申请(专利权)人：泰州施美康多肽药物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32