包含额外的二硫键的人胰岛素制造技术

本发明专利技术涉及包含额外的二硫键的人胰岛素及其制备方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及包含额外的二硫键的人胰岛素和desB30人胰岛素及其制备方法。专利技术背景糖尿病是代谢病，在这种病中，使用葡萄糖的能力部分或完全丧失。在糖尿病的治疗中，已经提出并使用了许多种胰岛素制剂，如常规胰岛素、低精蛋白锌胰岛素(称为NPH)，胰岛素锌悬浮液(如Semilente?、Lente?和Ultralente?)以及两相低精蛋白锌胰岛素。人胰岛素由两个多肽链组成，即A和B链，其分别包含21个和30个氨基酸残基。A和B链通过两个二硫键相互连接。来自大多数其它物种的胰岛素是相似的，但在一些位置可能包含氨基酸取代。在过去十年内，已经开发了许多人胰岛素类似物。它们是设计用于特定的作用模式，即快速作用或延长作用。包括这种胰岛素类似物的商业上可获得的产品包括Levemir?、NovoRapid?、Humalog?、Apidra?和Lantus?。多种蛋白酶的作用使人胰岛素在胃肠道的内腔中迅速降解，限制了其吸收进入循环系统。当与天然胰岛素相比，亲水的并且对蛋白水解性降解稳定的胰岛素类似物在动物模型中表现出更高的生物利用度。将二硫键引入蛋白是改善蛋白稳定性一种天然方式：已经发现二硫键的丰度和嗜热生物体间最高的生长温度之间的相关性，暗示了高温环境中二硫键在蛋白稳定中的重要性(Mallick P,等, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 9679-9684.:Ladenstein R,等, 2006, FEBS J., 273, 4170-4185)。也有许多成功地将二硫键工程化进蛋白并伴随稳定性增加的例子。对于芽孢杆菌RNAs获得了一种最高的稳定作用(Clarke J., Fersht A., 1993, Biochem., 32, 4322-4329)。通过增加解折叠(unfolding)所需的活化能，或者通过约束蛋白的解折叠的构象从而降低它们的构象熵，带来了这种稳定作用(Pace C.N., 1990, Trends Biol.Sci.,14-17)。然而，在这个新兴的研究领域，需要学习的多得多。至今，没有胰岛素中工程化的二硫键的报道。仍然需要稳定的新型人胰岛素类似物。专利技术概述本专利技术涉及具有两个或更多个半胱氨酸取代的人胰岛素类似物，其中保留人胰岛素的三个二硫键，选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成。在一个方面，获得了本专利技术的人胰岛素，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得(1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，以及(2)人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的所需的生物活性。在一个方面，获得了本专利技术的人胰岛素，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得(1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，(2)人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的所需的生物活性，以及(3)人胰岛素类似物相对于人胰岛素和/或母体胰岛素增加了物理稳定性。在一个方面，获得了本专利技术的人胰岛素，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得(1)引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，(2)人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的所需的生物活性，以及??(3)人胰岛素类似物对蛋白水解性降解是稳定的。本文还描述了用于稳定人胰岛素的方法，包括以半胱氨酸残基取代人胰岛素或desB30人胰岛素的两个或更多个氨基酸，其中保留所述人胰岛素的三个二硫键，选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，从而获得了包括不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的人胰岛素类似物。
技术实现思路
在本专利技术中，提供了新的人胰岛素类似物，其中将二硫键工程化进胰岛素。在一个方面，本专利技术的人胰岛素类似物具有两个或更多个半胱氨酸取代，保留了人胰岛素的三个二硫键。在本专利技术的一个方面，选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成。本专利技术人已经发现，本专利技术的人胰岛素类似物具有改善的物理稳定性。因此已经发现，例如，人胰岛素类似物暴露于热-机械应力和/或与不稳定的界面和表面如疏水表面和界面的相互作用导致的本专利技术的人胰岛素类似物形成人胰岛素类似物的无生物活性的和/或不溶性的聚集体的趋势降低。本专利技术的人胰岛素类似物结合于胰岛素受体。因此，本专利技术人已经惊讶地发现，本专利技术的人胰岛素类似物既具有改善的物理稳定性又保留了与胰岛素受体的结合。在一个方面，本专利技术的人胰岛素类似物针对蛋白水解性降解，即针对胃肠(GI)道中或身体其它部位的快速降解，是稳定的。在一个方面，相对于人胰岛素或desB30人胰岛素，本专利技术的人胰岛素类似物针对蛋白水解性降解是稳定的。针对蛋白水解性降解稳定的人胰岛素类似物在本文被理解为人胰岛素类似物，相对于人胰岛素，其经受一种或多种蛋白酶的更慢的降解。在一个实施方案中，相对于人胰岛素，本专利技术的人胰岛素类似物经受一种或多种蛋白酶的更慢的降解。在本专利技术的进一步的实施方案中，本专利技术的人胰岛素类似物针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：胃蛋白酶(如，例如，同种型胃蛋白酶A，胃蛋白酶B，胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F)，糜蛋白酶(如，例如，同种型糜蛋白酶A，糜蛋白酶B和/或糜蛋白酶C)，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶(IDE)，弹性酶(例如，同种型胰腺弹性酶I和/或II)，羧肽酶(例如，同种型羧基肽酶A，羧肽酶A2和/或羧肽酶B)，氨肽酶，组织蛋白酶D及源自大鼠、猪或人的肠提取物中存在的其它酶。在一个实施方案中，本专利技术的人胰岛素类似物针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶(IDE)，弹性酶，羧肽酶，氨肽酶和组织蛋白酶D。在进一步的实施方案中，本专利技术的人胰岛素类似物针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶，羧肽酶和IDE。在仍进一步的实施方案中，本专利技术的人胰岛素类似物针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶和IDE。在仍进一步的实施方案中，本专利技术的人胰岛素类似物针对一种或多种酶的降解是稳定的，该酶选自：糜蛋白酶和羧肽酶。“蛋白酶(protease)”或“蛋白酶(protease enzyme)”是消化酶，其使蛋白和肽降解，并且可以在人体的各种组织中发现它，例如胃(胃蛋白酶)，肠腔(糜蛋白酶，胰蛋白酶，弹性酶，羧肽酶，等)或胃肠道的粘膜表面(氨肽酶，羧肽酶，肠肽酶，二肽基肽酶，内肽酶，等等)，肝(胰岛素降解酶，组织蛋白酶D等)，和其它组织中。可以测定T?作为本专利技术的人胰岛素类似物对蛋白酶如糜蛋白酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.23 EP 10167036.2;2010.06.28 US 61/359,1271.人胰岛素类似物，具有两个或更多个半胱氨酸取代，其中保留了人胰岛素的三个二硫键，并且
选择半胱氨酸取代的位点的方式使得引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成。
2.权利要求1的人胰岛素类似物，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得
(1) 引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，以及
(2) 人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的期望的生物活性。
3.权利要求1或2的人胰岛素类似物，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得
(1) 引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，
(2) 人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的期望的生物活性，以及
(3) 相对于人胰岛素和/或母体胰岛素，人胰岛素类似物具有增加的物理稳定性。
4.前述权利要求中任一项的人胰岛素类似物，其中选择半胱氨酸取代的位点的方式使得
(1) 引入的半胱氨酸残基位于折叠的胰岛素类似物的三维结构中，以允许不存在于人胰岛素中的一个或多个额外的二硫键的形成，
(2) 人胰岛素类似物保留了与人胰岛素相关的期望的生物活性，以及
(3) 人胰岛素类似物对蛋白水解性降解是稳定的。
5.前述权利要求中任一项的人胰岛素类似物，其中用半胱氨酸取代A-链的A10位的氨基酸残基，用半胱氨酸取代选自B-链的B1、B2、B3和B4的位置中的氨基酸残基，以及任选地缺失B30位的氨基酸。
6.前述权利要求中任一项的人胰岛素类似物，其中用半胱氨酸取代A-链的A10位的氨基酸残基，用半胱氨酸取代选自B-链的B3和B4的位置中的氨基酸残基，以及任选地缺失B30位的氨基酸。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：F胡巴莱克，TN文瑟，TB克杰尔德森，S卢德维格森，
申请(专利权)人：诺沃—诺迪斯克有限公司，
类型：
国别省市：