本发明专利技术提出了一种对来源于米曲霉Aspergillus?oryzae的11家族的杂合木聚糖酶AEx11A进行耐热分析，通过对AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对，发现在AEx11A的N端引入了一个二硫键(Cys5-Cys32)。利用定点突变法将其5位的半胱氨酸突变为苏氨酸(C5T)，去除该二硫键，以探讨其对AEx11A热稳定性的影响，结果发现突变酶(AEx11AC5T)的Topt由突变前的75℃降为60℃、t1/270和t1/280分别由突变前的197和25min缩短为3.0和1.0min，说明N端二硫键对11家族木聚糖酶热稳定性有一定的影响。能为11家族木聚糖酶的热稳定机制的阐明、热稳定性蛋白工程的改造等奠定理论基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及源自11家族耐热杂合木聚糖酶AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对分析，突变木聚糖酶AExIIAg5t工程菌的构建以及突变木聚糖酶的高效表达、纯化和活性测定的方法，属于生物工程
技术介绍
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链,随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在工业造纸上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多工业中，木聚糖酶都需要在高温条件下进行操作，因此对木聚糖酶热稳定性的研究也引起了国内外研究的高度重视。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于11家族的木聚糖酶分子量较小，且结构比较简单，更适合作为理论研究的分子模型。许多研究结果表明11家族木聚糖酶的N末端区域对其稳定性起着很重要的作用。Lee等人对木聚糖酶XynA的N端进行删除突变，突变酶的热稳定性丧失但活性不变，从而确定了 N端是其热稳定区，卢雪丽等人引入二硫键提高黑曲霉XynIII热稳定性的研究。但N端二硫键对11家族耐热杂合木聚糖酶AExllA的热稳定性分析未见有文献或专利报告。本专利技术能为11家族木聚糖酶AExllA的热稳定机制的阐明、热稳定性蛋白工程的改造等奠定理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型地利用计算机和生物信息学知识，对11家族木聚糖酶AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对分析，运用基因工程的方法构建突变木聚糖酶工程菌以及突变木聚糖酶的高效表达、酶活性、最适温度的测定方法。本专利技术的技术方案一种源自11家族木聚糖酶AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对分析后，得出在端引入了一个二硫键(Cys5-Cys32)，利用定点突变法将5位的半胱氨酸突变为苏氨酸(C5T)突变前后的基因分别为AExIIA和AExIIAg5t。AExIIAc5t基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:1。11家族木聚糖酶pPIC9K_AExllA由江南大学医药学院分子生物学实验室制备和保藏。所述的由完整mRNA序列推导的AExIIAg5t氨基酸序列为SEQ ID NO :2。所述的突变木聚糖酶的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4. 6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的质量浓度为O. 5%的桦木木聚糖(Sigma,USA)溶液2. 4mL, 50°C预热IOmin,在A管中加入O. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应15min ;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷却后各加去离子水5mL，摇匀； 540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖 (以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生 I μ mo I还原糖所需的酶量定义为I个木聚糖酶活性单位(IU)。所述的突变酶的最适温度和热稳定性的测定在不同温度下，按上述方法测定酶活性，以最高酶活性为100%计算相对酶活性。 T-表示最适温度。将酶液置于不同温度下保温不同时间，按上述方法测定残余酶活性，以未处理的酶活性为100%。t1/2A表示在A°C下酶的半衰期，即残余酶活性为50%时的保温时间。所述的突变木聚糖酶基因的设计、克隆及表达(I)同源建模模拟AExllA的空间结构在PDB数据库中进行同源比对，寻找到与 AExllA 一级结构同源性较高、分别来源于绳状青霉菌Penicillium funiculosum(lTEl)、 E. coli (2VUL)和红褐肉座菌Hypocrea jecorina (IENX)的11家族木聚糖酶晶体结构，作为同源建模的模板。利用 SALIGN(http://salilab. org/DBAli/ page = tools_&action =f_salign)和 MODELLER 9. 9 (http: //salilab. org/modeller/)程序对 AExllA 进行同源建模。通过对AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对，发现在AExllA的 N端引入了一个二硫键(Cys5-Cys32)。利用定点突变法将其5位的半胱氨酸突变为苏氨酸 (C5T)，去除该二硫键，以探讨其对AExllA热稳定性的影响，突变前后的基因分别为AExllA 和 AEx I IAc5t。(2)突变基因AExIIAg5t及表达质粒的构建根据pPIC9K_AExllA(本实验是保存)设计引物Fl 5/ -GAATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT~3/，含 EcoR I 酶切位点和突变点 Thr5。Rl 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位点。以本实验室保存的pPIC9K_AExllA为模板，以Fl和Rl为引物进行PCR反应。 940C 2min ;30 个循环，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 12s ；72°C IOmin0 PCR 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接；转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序测序正确的pUCm-T-AExllAraT与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-AExllAG5T(图I)， 并对重组质粒进行测序鉴定。(3)GS115/AExllAC5T的构建、表达、产物纯化及活性测定用Sal I对 pPIC9K-AExlIAc5t进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/AExllAraT ;按照手册上的标准流程进行诱导表达；发酵液经离心后经过超滤膜浓缩、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化和SDS-PAGE分析；纯化的酶按照活性及最适宜温度的测定方法的测定。本专利技术的有益成果本研究利用定点突变法去除AExllAN端二硫键后，其最适温度和热稳定性明显降低，由此证实该二硫键是影响AExllA热稳定性的主要原因之一。同时为11家族木聚糖酶的耐热机制提供了准确可靠的实验依据。附图说明图I :重组质粒pPIC9K_AExllAG5T的构建示意图具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。实施例I同源建模模拟AExllA的空间结构在PDB数据库中进行同源比对，寻找到与AExllA —级结构同源性较高、分别来源于绳状青霉菌 Penicillium funiculosum(ITEl)、E. coli (2VUL)和红褐肉座菌 Hypocreajecorina(IENX)的11家族木聚糖酶晶体结构，作为同源建模的模板。利用SALIG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对来源于米曲霉Aspergillus?oryzae的11家族的杂合木聚糖酶AEx11A进行耐热分析。通过对AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对分析，定向突变以研究热稳定提高的原因，突变后的核苷酸(AEx11AC5T)序列为SEQ?ID?NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种对来源于米曲霉Aspergillus oryzae的11家族的杂合木聚糖酶AExllA进行耐热分析。通过对AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对分析,定向突变以研究热稳定提高的原因，突变后的核苷酸(AExIIAg5t)序列为SEQ ID NO :1。2.由权利要求I所述的突变的木聚糖酶基因(AExllAra)编码的突变木聚糖酶(AExIIAg5t),其完整的氨基酸序列对应于序列表中的为SEQ ID NO :2。3.AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对分析 同源建模AExllA的空间结构登录蛋白质结构数据库Protein data bank (http://rcsb. org)，经BLAST比对，找到与AExllA —级结构具有高度同源的，分别来自绳状青霉菌Penicilliumfuniculosum(ITEl)、E. coli (2VUL)和红褐肉座菌 Hypocrea jecorina(IENX)的11家族木聚糖酶晶体结构，作为同源建模的模板；其相似性分别为63. 7%、78. 8%和60. 9% ο 利用 SALIGN(http://salilab. org/DBAli/ page = tools_&action = f_salign)和 MODELLER 9. 9 (http://salilab. org/modeller/)程序对 AEx IlA 进行同源建模； 经比对发现由于N端替换,在AExl IA分子结构中引入了一个二硫键(Cys5-Cys32),其连接两个反向平行的折叠股(Al和Α2)，可能会通过降低蛋白质解折叠状态的熵，而对其热稳定性提高有一定的作用。4.突变木聚糖酶工程菌的构建和表达方法 (1)突变基因AExIIAg5t及表达质粒的构建 根据pPIC9K-...
【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，余涛，殷欣，李剑芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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