一种验证二硫键对木聚糖酶热稳定性影响的方法技术

本发明专利技术提出了一种对来源于米曲霉Aspergillus?oryzae的11家族的杂合木聚糖酶AEx11A进行耐热分析，通过对AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对，发现在AEx11A的N端引入了一个二硫键(Cys5-Cys32)。利用定点突变法将其5位的半胱氨酸突变为苏氨酸(C5T)，去除该二硫键，以探讨其对AEx11A热稳定性的影响，结果发现突变酶(AEx11AC5T)的Topt由突变前的75℃降为60℃、t1/270和t1/280分别由突变前的197和25min缩短为3.0和1.0min，说明N端二硫键对11家族木聚糖酶热稳定性有一定的影响。能为11家族木聚糖酶的热稳定机制的阐明、热稳定性蛋白工程的改造等奠定理论基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及源自11家族耐热杂合木聚糖酶AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对分析，突变木聚糖酶AExIIAg5t工程菌的构建以及突变木聚糖酶的高效表达、纯化和活性测定的方法，属于生物工程

技术介绍
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链,随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在工业造纸上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多工业中，木聚糖酶都需要在高温条件下进行操作，因此对木聚糖酶热稳定性的研究也引起了国内外研究的高度重视。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于11家族的木聚糖酶分子量较小，且结构比较简单，更适合作为理论研究的分子模型。许多研究结果表明11家族木聚糖酶的N末端区域对其稳定性起着很重要的作用。Lee等人对木聚糖酶XynA的N端进行删除突变，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对来源于米曲霉Aspergillus?oryzae的11家族的杂合木聚糖酶AEx11A进行耐热分析。通过对AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对分析，定向突变以研究热稳定提高的原因，突变后的核苷酸(AEx11AC5T)序列为SEQ?ID?NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种对来源于米曲霉Aspergillus oryzae的11家族的杂合木聚糖酶AExllA进行耐热分析。通过对AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对分析,定向突变以研究热稳定提高的原因，突变后的核苷酸(AExIIAg5t)序列为SEQ ID NO :1。2.由权利要求I所述的突变的木聚糖酶基因(AExllAra)编码的突变木聚糖酶(AExIIAg5t),其完整的氨基酸序列对应于序列表中的为SEQ ID NO :2。3.AExllA结构的同源建模及其与AoXynllA结构的比对分析 同源建模AExllA的空间结构登录蛋白质结构数据库Protein data bank (http://rcsb. org)，经BLAST比对，找到与AExllA —级结构具有高度同源的，分别来自绳状青霉菌Penicilliumfuniculosum(ITEl)、E. coli (2VUL)和红褐肉座菌 Hypocrea jecorina(IENX)的11家族木聚糖酶晶体结构，作为同源建模的模板；其相似性分别为63. 7%、78. 8%和60. 9% ο 利用 SALIGN(http://salilab. org/DBAli/ page = tools_&action = f_salign)和 MODELLER 9. 9 (http://salilab. org/modeller/)程序对 AEx IlA 进行同源建模； 经比对发现由于N端替换,在AExl IA分子结构中引入了一个二硫键(Cys5-Cys32),其连接两个反向平行的折叠股(Al和Α2)，可能会通过降低蛋白质解折叠状态的熵，而对其热稳定性提高有一定的作用。4.突变木聚糖酶工程菌的构建和表达方法 (1)突变基因AExIIAg5t及表达质粒的构建 根据pPIC9K-...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，余涛，殷欣，李剑芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：