通过N端增加二硫键提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法技术

通过N端增加二硫键提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法。本发明专利技术提出了一种新型的利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行定向改造的方法，运用基因工程的方法构建具有高效表达能力的杂合木聚糖酶工程菌。将来源于米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186菌株的常温木聚糖酶基因进行热稳定性定向改造，获得了一种杂合木聚糖酶，其热稳定性有了一定的提高，相对于原酶而言活性没有降低，作为一种耐热型的酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产潜力和经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的常温木聚糖酶(AoXynllA)基因进行热稳定性定向改造，杂合木聚糖酶工程菌的构建及重组杂合木聚糖酶的高效表达的方法，属于生物工程

技术介绍
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链,随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在工业造纸上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多工业中，木聚糖酶都需要在高温条件下进行操作，因此对木聚糖酶耐热性的研究也引起了国内外研究的高度重视。开发耐热型木聚糖酶的研究主 要包括筛选超耐热的木聚糖酶生产菌和利用基因工程对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的亲睐。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种源自米曲霉(Aspergillus?oryzae)CICC?40186、归属于糖苷水解酶第11家族的常温木聚糖酶基因Aoxyn11A，以另一个同家族的超耐热木聚糖酶基因Syxyn11(GenBank?accession?NO.JX459567)模板，利用计算机技术及其相关软件，结合分子动力学模拟的方法，对AoXyn11A分子进行理性设计，定向改造以提高热稳定性。

【技术特征摘要】
1.一种源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、归属于糖苷水解酶第11家族的常温木聚糖酶基因AoxynllA,以另一个同家族的超耐热木聚糖酶基因Syxynll (GenBankaccession NO. JX459567)模板，利用计算机技术及其相关软件，结合分子动力学模拟的方法，对AoXynllA分子进行理性设计,定向改造以提高热稳定性。2.利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因 (1)同源建模模拟AoXynllA的空间结构登录蛋白质结构数据库Proteindatabank (http ://rcsb. org),经BLAST比对,找到与AoXynllA具有高度同源的序列；本实验选择热稳定非常高的EvXynlIts (Protein Data Bank登录号为2VUL)为模板，并且两者的同源性为66. 49%，运用SWISS-MODEL服务器在线全自动为A. oryzae常温木聚糖酶成熟肽构建空间结构；运用软件Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性较高的空间结构模型； (2)利用分子动力学模拟的方法理性设计热稳定性提高的杂合基因通过序列比较，我们把EvXynlIts前面5个氨基酸(NAQTC)添加到AoXynllA的N端，再把杂合酶的32位T改为C，然后我们以EvXynlIts为模板，对杂合木聚糖酶进行同源建模，再运用分子动力学模拟方法分别对杂合酶和原酶进行总体能量及RMSD值计算，由结果我们得出杂合酶的总体能量和RMSD值相对于原酶而言较小，即热稳定性较好。3.杂合木聚糖酶工程菌的构建和表达方法 (I)杂合基因AoxynllA1表达质粒的构建根据GenBank上AoxynllA基因序列(GenBank accessionNo. JQ326257)设计 3 个引物Xynll-F :5’ -CTCGAGAAAAGAAACGCTCAAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，陈忠法，胡蝶，李剑芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：