一种内切葡聚糖酶编码基因和重组酶及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种内切葡聚糖酶编码基因和重组酶及应用，属于生物技术领域。一种内切葡聚糖酶编码基因，其序列如SEQ?ID?NO.1；内切葡聚糖酶的重组酶其序列如SEQ?ID?NO.2所述。实验证明，本发明专利技术的重组内切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纤维素酶活性，达到2245U/mL，菌落的透明圈直径是原始菌株的30倍以上。本发明专利技术所提供的内切葡聚糖酶编码基因和重组酶可广泛应用于纤维素的降解。

【技术实现步骤摘要】
—种内切葡聚糖酶编码基因和重组酶及应用
本专利技术属于生物
，涉及一种内切葡聚糖酶编码基因和重组酶及应用。
技术介绍
纤维素是生物圈中产量最丰富的一种碳水化合物资源，占植物干重的35%_50%， 分布广泛。纤维素呈长链状高分子，由葡萄糖苷通过β-1，4糖苷键连接而成，分子量一般为50000-2500000，相当于300-15000个葡萄糖单位，是葡萄糖的一种重要贮存形式，但是由于降解困难，导致纤维素资源的利用率非常的低。纤维素大分子可被纤维素酶所降解。纤维素酶是一个酶系，根据其催化反应功能的不同，可以把纤维素分为内切葡聚糖酶(endo-l, 4_ β -D-glucanase, EC3. 2. I. 4,即 Cl 酶)，外切葡聚糖酶(1，4- β -D-glucan celIobiIhydrolase 或 exo_l, 4_β -D-glucannase, EC. 3. 2. I. 91),和 β -葡聚糖苷酶 (β -I, 4-glucosidase，EC. 3. 2. I. 21)简称BG。一般认为，内切葡聚糖酶是纤维素酶系中最重要的酶，可以作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解糖苷键，将长链纤维素分子截成短链状，产生小分子纤维素，可以为外切酶提供大量的反应末端，同时还能水解小分子的纤维素寡糖。纤维素酶的研究与开发是纤维素资源综合利用的基础。目前研究者对真菌的纤维素酶研究开发较多，而在细菌中开发高效纤维素酶系的研究要少很多。纤维素降解细菌的研究大多是芽胞杆菌类，在Pantoea ananatis中的研究未有报道。随着分子生物学、基因工程的迅猛发展，国内外均尝试应用基因工程技术来构建高效纤维素降解菌株、开发新型高效的纤维素酶系。由于内切葡聚糖酶在纤维素酶系中的重要地位，因此需要通过生物技术方法加大对细菌内切葡聚糖酶的研究，构建重组内切葡聚糖酶工程菌，并开展酶学性质、 酶产品的研究，以推动纤维素酶的应用和纤维素资源的开发利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型内切葡聚糖酶编码基因eg的基因序列及其氨基酸序列。采用PCR方法克隆获得内切葡聚糖酶编码基因。本专利技术的一种新型内切葡聚糖酶编码基因eg，所述内切葡聚糖酶的基因序列为 SEQ ID NO. I。所述内切葡聚糖酶的基因eg是一个完整的开放阅读框(0RF)，该开放阅读框以启始密码子ATG开始，以终止密码子TGA结束，共包括1005bp。本专利技术的一种新型重组内切葡聚糖酶，所述重组酶的氨基酸序列为SEQ IDN0. 2。所述内切葡聚糖酶共334个氨基酸序列。本专利技术的另一目的，在于提供一种新型重组内切葡聚糖酶EG。该重组酶具有很高的酶活性，达到2245U/mL。上述重组内切葡聚糖酶EG的制备方法，包括如下步骤(I)重组内切葡聚糖酶菌株EG/BL21(DE3)的构建以 F: CATATGAGAGTTAAGCCAGTGT 和 R: CTCGAGACGCTTTTCCTGATAA 为 PCR 反应的引物；以PCR方法从菌株Pantoea ananatis P5 (CGMCCN0. 5356)基因组中克隆获得内切葡聚糖酶编码基因eg全长，将该基因通过限制性内酶NdeI和XhoI酶切后，连接到原核表达载体PET258中，构建重组质粒pETEG，转化大肠埃希氏菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞，利用PCR反应检测(引物为F和R)和限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切检测两种方法，筛选获得高效表达重组内切葡聚糖酶的菌株，即重组大肠埃希氏菌EG/BL21 (DE3)；(2)重组菌株EG/BL21 (DE3)的发酵培养与诱导表达将重组菌株EG/BL21 (DE3)按1%接种量转接到50mL LB (含30 μ g/mL卡那霉素) 液体培养基中于37°C震荡培养；待0D_为O. 5时，加入O. ImM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导4h终止发酵；将发酵液在_80°C速冻，放冰水中缓慢融化完全，使用超声波破碎细胞，10000r/min离心5min，取上清即为粗酶液；(3)重组内切葡聚糖酶的纯化将上清加到Ni-NTA柱上，使带有His标签的重组内切葡聚糖酶结合到柱子上；使用PH8. O的洗脱溶液(含50mM NaH2PO4,300mM NaCl、250mMimidazole)将重组内切葡聚糖酶从柱子上洗脱下来，并将酶液在超离心浓缩管中浓缩，获得纯度高于95%以上的内切葡聚糖酶蛋白。本专利技术的再一目的，在于提供上述新型重组内切葡聚糖酶EG的应用。所述内切葡聚糖酶能够应用于生产纤维素酶，应用于纤维素的降解。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和有益效果(I)根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶的分子量、等电点和酶学特性等特性与已知蛋白的差异判断，该重组内切葡聚糖酶EG是一种新型β-1，4-内切葡聚糖酶基因。 这是首次从Pantoea ananatis菌株中开发出重组β-1,4-内切葡聚糖酶基因。(2)该重组内切葡聚糖酶EG具有适应温度范围广、耐较强酸碱性的特点，在生物能源、洗衣纺织、食品加工、发酵生产等多个行业中具有应用潜力。附图说明图I是内切葡聚糖酶基因的克隆与检测的琼脂糖凝胶电泳图。I :内切葡聚糖酶基因PCR扩增结果；2 :菌落PCR鉴定阳性结果；3 =NdeI和Xho I 双酶切割过的重组质粒，小带是切出的目的基因，大带是空载体；4 =NdeI单酶切的重组质粒；5 =Xho I单酶切的重组质粒；6 :没切割的重组质粒对照；M1 :1KB，从上到下一次大小为；10kb，8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，Ikb ；M2 D2000,从上到下一次大小为 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp ;重组内切葡聚糖酶基因以左侧箭头标出。图2是重组菌株EG/BL21(DE3)在羧甲基纤维素钠培养基上形成的透明圈图。图3是重组菌株EG/BL21 (DE3)内切葡聚糖酶蛋白诱导表达的SDS-PAGE图。图中1 :诱导前；2 :诱导3hr ；3 :诱导4hr ；4 :诱导5hr ；M :蛋白Marker,大小标于左侧；重组内切葡聚糖酶蛋白以右侧箭头标出)图4是重组内切葡聚糖酶纯化的SDS-PAGE图。图中1 :诱导前；2 :诱导4hr ；3 :纯化的重组内切葡聚糖酶蛋白。具体实施方式I、主要材料(I)培养基LB液体培养基每L培养基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaClIOg ；LB固体培养基每L培养基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaClIOg琼脂粉12g ；产透明圈培养基每IL培养基中含有羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，KH2PO4 lg, MgSO4 O. 2g，NaCl 10g，葡萄糖 2g，琼脂粉 12g ；(2)实验仪器设备YXQ-LS-75立式压力蒸汽灭菌锅——上海博讯实业有限公司医疗设备厂PCR扩增仪——美国ABI公司FA2004电子天平——上海越平科学仪器有限公司DNP-9162型电热恒温培养箱——上海精宏实验设备有限公司YXJ-2高速离心机——常州国华电器有限公司Sigma3 16pk台式闻速冷冻尚;L·、机德国SIGMA公司低速离心机——常州国华本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组内切葡聚糖酶编码基因，其特征在于：所述酶基因序列为SEQ？IDNO.1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯进慧，刘彤，陈宏伟，王富威，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：