重组Ⅱ型限制性内切核酸酶ＭｍｅＩ和相关内切核酸酶以及制备这些酶的方法技术

根据本发明专利技术，提供一种编码重组Ⅱ型限制性内切酶ＭｍｅＩ的ＤＮＡ（脱氧核糖核酸）片段。这种酶具备两种相关的酶学功能；一个是识别ＤＮＡ序列５’－ＴＣＣ（Ｐｕ）ＡＣ－３’的内切酶活性，并在如箭头标记的地方剪切ＤＮＡ：５’－ＴＣＣＲＡＣ（Ｎ２０）↓－３’和３’－ＡＧＧＹＴＧ（Ｎ１８）↑－５’，另一个酶活性是识别同样的ＤＮＡ序列５’－ＴＣＣ（Ｐｕ）ＡＣ－３’，但是通过增加甲基的方式来修饰该序列以防止ＭｍｅＩ内切酶活性的剪切。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是分案申请，原申请的申请日为2003年7月10日、申请号为03816564.3(PCT/US2003/021570)、专利技术名称为“重组II型限制性内切核酸酶MmeI和相关内切核酸酶以及制备这些酶的方法”。
技术介绍
本专利技术涉及DNA(脱氧核糖核酸)片段，该片段编码具有两种相关的酶功能的多肽，一个酶功能是识别DNA序列5’-TCC(Pu)AC-3’并且剪切位于这个识别序列3’端第20和第21个残基之间的磷酸二酯键以及互补链上的识别序列5’-GT(Py)GGT-3’的5’端第18和19个残基之间的磷酸二酯键，从而产生具有两个碱基的3’粘末端(以下称为MmeI限制性内切酶)，而第二个酶活性是识别同样的DNA序列，5’-TCC(Pu)AC-3’，但是通过增加一个甲基来修饰这段序列以防止内切酶MmeI的剪切。本专利技术还涉及含有该DNA片段的载体、含有该DNA片段的转化宿主，以及从这样的转化宿主中制备出MmeI限制性内切酶的改进的方法。本专利技术还涉及鉴定编码具有和MmeI同样特性但却很可能具有独特的DNA识别序列的酶的其它DNA片段的方法。这个方法依赖于本申请中所提出的MmeI酶的氨基酸序列的使用，或者由此依赖于通过这个方法鉴定出来的别的序列。本专利技术还涉及可以通过所述的该方法鉴定出来的其它的DNA片段，这些片段中的每一个都编码与MmeI多肽具有显著的氨基酸序列相似性的多肽。由这些DNA片段编码的多肽被预测表现出和MmeI相似的功能。特别地，这些多肽被预测具有双重的酶学功能在离特异性识别序列相对远的距离处以特异性的方式剪切DNA，而又修饰它们的识别序列以防止宿主DNA由于内切酶活性而被剪切。通过这种方法鉴定出来的酶的一个实例是CstMI(参见申请序列号为10/616,689的美国专利申请，其与本申请同时提交)。CstMI由于其与MmeI高度显著的氨基酸序列相似性而被认为是一种潜在的内切酶。CstMI识别序列5’-AAGGAG-3’，并剪切位于该识别序列3’端第20和第21个残基之间的磷酸二酯键以及互补链上识别序列5’-CTCCTT-3’的5’端第18和19个残基之间的磷酸二酯键，由此产生具有两个碱基的3’粘末端。 限制性内切酶是一类自然存在于原核生物中的酶。已知的限制性酶切系统有好几种，其中II型内切酶是在遗传工程中非常有用的一类。当这些II型内切酶与原核生物中的其它杂质组分分开而被纯化出来以后，就可以在实验室中用来将DNA分子打断成准确的片段。这种特性使得DNA分子可以被特定地鉴定出来并且被分到它们的组成基因中。限制性内切酶已经被证明是现代遗传学研究中不可或缺的工具。它们是生物化学上的“剪刀”，通过它们遗传工程和分析得以进行。 限制性内切酶通过识别并结合到DNA分子上特定的核苷酸序列(“识别序列”)而起作用。一旦结合到DNA序列上，II型内切酶就在这段序列的内部或者是一侧剪切核酸分子。不同的限制性内切酶对不同的识别序列具有亲和性。大多数限制性内切酶识别的序列长度为4到6个核苷酸，虽然最近也有少数识别7或8个特异核苷酸的限制性内切酶已经被分离出来。绝大多数识别序列都含有一对对称轴，而且在绝大多数情况下所有的核苷酸都是独特地确定的。然而，有些限制性内切酶具有简并或者不严格的特异性，因为它们在它们的识别序列中一个或者多个位置处识别多种碱基，而且有的限制性内切酶识别非对称的序列。HaeIII识别的序列是5’-GGCC-3’，这是具有对称性、非简并识别序列的一个实例；HaeII识别的序列是5’-(Pu)GCGC(Py)-3’，这是典型的具有简并的或者不严格的识别序列的限制性内切酶；而BspMI识别的序列为5’-ACCTGC-3’，这是典型的具有非对称识别序列的限制性内切酶。具有对称性识别序列的II型内切酶一般对称地在识别位点内部或者与之相邻的位置剪切，而那些识别非对称序列的限制性内切酶往往在距离识别位点一端1到20个碱基范围内剪切。本申请的酶MmeI(还有CstMI)具有的特性就是在距离所有已知的II型限制性内切酶的识别序列最远的位置剪切DNA。目前有多于200种独特的限制性内切酶在几千种已经研究过的细菌物种中被鉴定出来。 限制性系统的另一个组分是甲基化修饰酶。这些酶与限制性内切酶互补，它们为细菌提供可以保护自身的DNA并与外源侵染的DNA区分开来的手段。甲基化修饰酶识别并结合到与对应的限制性内切酶同样的识别序列上，但它们不是打断DNA，而是通过添加甲基基团来化学修饰序列中的一个或者其它的核苷酸。甲基化之后，识别序列便不再会被限制性内切酶剪切。细菌细胞的DNA借助它的甲基化修饰酶的活性而被修饰，因而它对内源限制性内切酶的存在变得不敏感。只有未被修饰因而也就被认为是外源的DNA才对限制性内切酶的识别和剪切敏感。甲基转移修饰酶常常是不同于它们的同源内切酶伴侣的另外一种酶。在某些情况下，一种单个的多肽同时具有甲基转移修饰酶和内切酶的功能，比如Eco57I。在这样的情况下，会有另外一个甲基转移酶存在并作为限制-修饰系统的一部分。相反，本申请中的MmeI系统没有另外的甲基转移酶与内切酶-甲基转移酶多肽相伴。 内切酶的命名是根据它们来源的细菌而制定的。因此，比如嗜血杆菌(Haemophilus ageyptius)合成三种不同的限制性内切酶，它们就会被命名为HaeI、HaeII和HaeIII。这些酶识别和剪切的序列分别为5’-(W)GGCC(W)-3’、5’-(Pu)GCGC(Py)-3’和5’-GGCC-3’。另一方面，大肠杆菌(Escherichia coli)RY13只合成一种内切酶EcoRI，它识别的序列是5’-GAATTC-3’。 虽然并不想受到理论的约束，但是一般认为在自然界中，限制性内切酶在细菌细胞的保障系统中起着保护性作用。它们可以使细菌能够抵抗外源DNA分子比如病毒或者质粒的侵染，不然这些分子可能会破坏或者寄生于细胞。它们是通过识别侵染DNA分子中出现的识别序列并在这些位置剪切DNA而达到抵抗的目的。由此产生的这种瓦解使得很多侵染性的基因失活，而且促使这些DNA易于进一步被外切酶降解。 已经有多于3000种限制性内切酶从各种细菌株系中被分离出来。其中超过240种是识别独特的序列，而其他种类的内切酶则分享共同的识别特异性。识别同样的核苷酸序列的限制性内切酶被称为“同裂酶(isoschizomer)”。虽然同裂酶的识别序列是一样的，但是它们的剪切位点却有可能会不同(比如XmaI和SmaI，Endow等，J.Mol.Biol.112521(1977)；Waalwijk等，Nucleic Acids Res.53231(1978))，并且在不同位点的剪切速率也会有所不同(XhoI和PaeR7I，Gingeras等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80402(1983))。 限制性内切酶传统地被分成三个主要的大类I型、II型和III型。I型限制性系统召集多种肽构成复合物，其由限制性多肽、修饰性多肽和特异性或者DNA识别多肽组成。I型系统需要二价阳离子、ATP和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为辅助因子。I型系统剪切DNA的位置随机，最远可以在距离它们的特异性识别位点几千个碱基对的位置。III型系统本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的ＤＮＡ，其编码结合了内切核酸酶活性和修饰活性的限制性酶，并具有编码保守氨基酸基序的核苷酸序列，所述保守基序是（Ｄ／Ｅ）Ｘ８－Ｘ１２（Ｄ／Ｅ）ＸＫ，并且此时，在利用图３的氨基酸序列的Ｂｌａｓｔ搜索中，所述编码的氨基酸序列的期望值（ｅ）分数低于Ｅ＝ｅ↑［－１０］。

【技术特征摘要】
US 2002-7-12 60/395,4311.分离的DNA，其编码结合了内切核酸酶活性和修饰活性的限制性酶，并具有编码保守氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：RD摩根，T巴蒂亚，T戴维斯，L洛沃什科，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：US[]